目的  采用层次分析法和响应面法优化新疆一枝蒿的提取工艺。

方法  在单因素优选的基础上结合响应面法对提取次数、溶剂倍数、提取时间3个主要因素进行考察，以木犀草素、芹菜素、一枝蒿酮酸的含量及出膏率为考察指标，层次分析法计算权重系数，通过综合评分优选新疆一枝蒿的提取工艺。

结果  新疆一枝蒿的提取工艺为：用10倍量60%乙醇加热回流提取3次，每次1 h。

结论  优化的工艺提取条件简便，重现性良好，适用于新疆一枝蒿药材的提取。

新疆一枝蒿Artemisia rupestris L.系菊科蒿属多年生草本植物一枝蒿的药用全草。我国主要分布在新疆，现收载于《中华人民共和国卫生部国家药品标准（维吾尔药分册）》和《维吾尔药志》，是维吾尔医常用药材，具有抗炎、抗过敏、祛风解毒等功效，临床上用于治疗感冒、肝炎、过敏性疾病等[1-3]。文献报道一枝蒿全草含有黄酮类、酮酸类、倍半萜类、挥发油、多种生物碱、内酯类及氨基酸等化合物[4-5]。现代药理学研究表明，新疆一枝蒿药材中的木犀草素、芹菜素、一枝蒿酮酸均具有抗炎和镇痛等药理作用[6-8]。因此本研究将上述3种成分的含量与出膏率作为检测指标，采用层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）确定待测指标的权重系数并结合响应面法（response surface methodology，RSM）Box-Behnken设计试验[9-11] ，优选新疆一枝蒿药材的最佳提取工艺参数，为后续新疆一枝蒿药材的研究开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000系列高效液相色谱仪（美国Thermo Scientific Technologies公司）；DT500A型电子计数天平（d=0.01 g，常熟市金羊砝码仪器有限公司）；CPA-225D型电子天平（d=0.01 mg，德国Sartorius赛多利斯）。

1.2 试药

木犀草素对照品（批号：111520-200504，含量：99.6%）、芹菜素对照品（批号：111901-201102，含量：99.2%）均购于中国食品药品检定研究院；一枝蒿酮酸对照品（中国科学院新疆理化所，批号：115473-63-7，含量大于98%）；新疆一枝蒿药材购于新疆银朵兰维药股份有限公司，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定，符合《新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范》有关规定[12]；乙腈、甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

称取新疆一枝蒿药材约5 g，按响应面设计方案（表10）进行试验，提取液过滤，用60%乙醇定容至250 mL，摇匀，滤过，即得。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 一枝蒿酮酸对照品溶液的制备

精密称取一枝蒿酮酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.4431 mg的溶液，即得。

2.2.2 木犀草素对照品溶液的制备

精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.3712 mg的溶液，即得。

2.2.3 芹菜素对照品溶液的制备

精密称取芹菜素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.2834 mg的溶液，即得。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件的建立

    Hypersil BDS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇（A）-0.15%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~10 min，25%A∶75%B；10~16 min，28%A∶72%B；16~30 min，30%A∶70%B），流速为1.0 mL·min^-1，柱温为30 ℃，进样量为10 µL，检测波长250 nm[13]。色谱图见图1。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatograms

  注：a.木犀草素；b.一枝蒿酮酸；c.芹菜素

  

2.3.2 线性关系考察

一枝蒿酮酸标准曲线 ：分别精密量取0.1，0.2，0.4，0.6，1.2 mL一枝蒿酮酸对照品溶液于5 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 µL,注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下方法测定，记录峰面积，进行线性回归，结果见表1。

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  表格1 各成分线性关系

  Table 1.Linear relationships of various constituents

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木犀草素标准曲线：分别精密量取0.2，0.6，1，3，4 mL木犀草素对照品溶液于10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 µL,注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下方法测定，记录峰面积，进行线性回归，结果见表1。

芹菜素标准曲线：分别精密量取0.1，0.2，0.6，1，1.5 mL芹菜素对照品溶液于10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 µl,注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下方法测定，记录峰面积，进行线性回归，结果见表1。

2.3.3 精密度试验

精密度试验取同一对照品溶液（木犀草素0.0371 mg·mL^-1，一枝蒿酮酸0.0354 mg·mL^-1，芹菜素0.0170 mg·mL^-1）连续进样6次，按“2.3.1”项下方法测定，记录色谱峰面积，结果木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素的峰面积RSD分别为1.54%、1.68%、1.18%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性

取同一供试品溶液，分别于0，2，6，8，12，24 h测定，按“2.3.1”项下方法测定，记录色谱峰面积并计算含量。结果木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素的峰面积RSD分别为1.26%、1.44%、1.30%（n=6），表明溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性

取样品6份，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下方法测定，记录色谱峰面积并计算含量，结果木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素的含量RSD分别为1.17%、1.45%、1.22%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率

称取新疆一枝蒿药材约2.5 g，共6份，分别按处方药材浓度的100%比例加入各对照品溶液，测得木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素的平均回收率分别为99.70%，98.28%，98.70%，RSD分别为1.20%、1.43%、1.33%（n=6）。

2.4 出膏率测定

精密称取新疆一枝蒿药材5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加乙醇适量进行回流提取，合并提取液浓缩至适量，置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于60 ℃干燥12 h后置于干燥器中冷却，精密称定其质量，按下式计算出膏率：出膏率=干浸膏质量/药材质量×100%。

2.5 提取工艺综合评分指标的确定

采用AHP法对干浸膏得率和指标性成分含量作为权重指标予以量化。当一致性比例因子CR＜0.1时, 判断矩阵具有一致性[14-15]。本研究根据木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素的成分含量及出膏率4项指标为考查内容采用AHP法构成成对比较的判断优先矩阵，并获得各项指标的相对评分(评分标准可参见文献[14-15]的判断矩阵1-9标度法）。结果见表2。

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  表格2 指标成对比较判断优先矩阵

  Table 2.Priority matrix which is pairwise comparison of objectives

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2.5.1 计算初始权重系数

按公式 计算初始权重系数Wi'。

2.5.2 计算归一化权重系数

按公式计算归一化权重系数Wi。

2.5.3 一致性检验

根据矩阵最大特征根公式（1）~（3）计算随机一致性比率

式中m为受检验层次的次目标数，CI 为一致性检验因子，RI为平均随机一致性指标，CR为矩阵最大特征根，表示一致性比例因子。λmax为最大特征根，Wi'为初始权重系数，Wi为归一化权重系数。

经计算CR=CI/RI=0.024＜0.1表明此4项指标优先比较矩阵满足一致性要求，计算的权重系数合理有效。一枝蒿酮酸、木犀草素、芹菜素、干浸膏4项指标经层次分析后得到的权重系数分别是0.4168，0.2695，0.1928，0.1209。最终得到的综合评分公式如下：综合评分=（一枝蒿酮酸含量/一枝蒿酮酸最大含量）×0.4168×100+（木犀草素含量/木犀草素最大含量）×0.2695×100+（芹菜素含量/芹菜素最大含量）×0.1928×100+（干浸膏得率/干浸膏最大得率）×0.1209×100。

2.6 单因素试验

本试验以木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素和出膏率的综合评分进行评估，优选最佳因素。

2.6.1 提取次数的考察

称取新疆一枝蒿药材约5 g，按表3安排，进行提取次数的考察，结果见表4，表明以提取次数3次的各项含测指标的综合评分高于其他。

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  表格3 单因素考察提取次数

  Table 3.Investigation of extraction times by single factor

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  表格4 单因素考察提取次数综合评分结果

  Table 4.Comprehensive grading results of investigation of extraction times by single factor

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2.6.2 溶剂倍数的考察

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  表格5 单因素考察溶剂倍数

  Table 5.Investigation of solvent multiple by single factor

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称取新疆一枝蒿药材约5 g，按表5安排，进行溶剂倍数的考察，结果见表6。表明以加入10倍量，其各含测指标的综合评分高于其他，故选择10倍量为提取溶剂倍数。

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  表格6 单因素考察溶剂倍数综合评分结果

  Table 6.Comprehensive grading results of investigation of solvent multiple by single factor

  

2.6.3 提取时间的考察

称取新疆一枝蒿药材约5 g，按表7安排，进行提取时间的考察，结果见表8。表明以1 h为提取时间，其各项含测指标的综合评分高于其他，故选择1 h为提取时间。

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  表格7 单因素考察提取时间

  Table 7.Investigation of extraction time by single factor

  

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  表格8 单因素考察提取时间综合评分结果

  Table 8.Comprehensive grading results of investigation of extraction time by single factor

  

2.7 Box-Behnken试验

在单因素优选的基础上，根据影响一枝蒿酮酸、木犀草素、芹菜素的含量及出膏率的主要因素选取提取时间、提取次数、溶剂倍数为3个因素作为考察因素，各因素选取3个水平，进行Box-Behnken，优选合理的条件组合，各因素水平见表9，试验安排与试验结果见表10，对试验数据进行方差分析结果见表11。

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  表格9 响应面法分析因素与水平

  Table 9.Analytical factors and levels for response surface methodology analysis

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  表格10 响应面分析试验设计与结果

  Table 10.Design and results of response surface analysis tests

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采用Design Expert 12.0 软件进行响应面分析，以综合评分为响应值，通过二阶多项式得到回归方程Y=98.19+5.01A+2.20B+1.72C-0.11AB+0.37AC-0.35BC-4.48A²-3.23B²-2.17C²。方差分析见表11。

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  表格11 回归模型的方差分析结果

  Table 11.Variance analysis result of regression model

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由表11可知。建立的数学模型以及模型中的A、B、C、A2、B2、C2均具有统计学意义（P＜0.0001）。结合模型（P＜0.0001）及失拟项（P＞0.05），说明试验误差较小。根据二次多项式模型，应用Design Expert 12.0 软件绘制三维响应曲面，见图2。由回归模型进行预测分析，综合评分的预测值98.186，最优提取条件为提取次数3次，溶剂倍量10倍，提取时间1 h。

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  图2 综合评分的三维响应图

  Figure 2.The response surface figure of synthetical score

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2.7.1 验证试验

根据响应面优化的最佳条件，平行称取3份新疆一枝蒿药材约5 g，加入10倍量60% 乙醇，回流提取3次，每次1.0 h，结果见表12。结果表明，一枝蒿酮酸、木犀草素、芹菜素含量及出膏率的综合评分的相对误差均小于5%，说明最佳提取工艺稳定，重现性好。

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  表格12 验证试验结果（n=3）

  Table 12.Results of experimental verification(n=3)

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3 讨论

3.1 选择60%乙醇提取依据

据文献报道新疆一枝蒿全草含有黄酮类、酮酸类、倍半萜类、挥发油、多种生物碱、内酯类及氨基酸等化合物[4-5]。现代药理学研究表明，新疆一枝蒿药材中的木犀草素、芹菜素、一枝蒿酮酸均具有抗炎和镇痛等药理作用[6-8]。且其中的木犀草素、芹菜素、一枝蒿酮酸在60%乙醇中均有较好的的溶解度[9-15]，故以60%乙醇作为新疆一枝蒿药材的提取溶媒。

3.2 色谱条件的筛选

流动相组成上分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液-甲醇、乙腈-0.15%磷酸溶液-甲醇，同时考察了不同品牌和不同型号的色谱色谱柱以及柱温、流速、梯度洗脱对试验结果的影响，以色谱峰数目、基线、峰形对称及分离度为筛选指标，最终确定流动相乙腈（A）-0.15%磷酸溶液（B）-甲醇（C）系统进行梯度洗脱。色谱图显示木犀草素、一枝蒿酮酸、芹菜素出峰时间较合适且峰形对称、分离度佳。

3.3 含测指标加权系数的确定

本研究以新疆一枝蒿中抗炎活性成分一枝蒿酮酸、木犀草素、芹菜素含量及出膏率4项指标为考查内容并依此构成成对比较的判断优先矩阵，采用AHP法对各成分进行系数加权，以加权后综合评分为因变量，不仅能全面地反映各活性成分在药材中的重要程度，也能直观地反映整体提取工艺。

3.4 Box-Behnken响应面法设计

Box-Behnken法通过多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，能够准确表示试验设计与优化结果，准确度高、可预测性强。通过建立综合评分与关键工艺参数的数学模型，并运用该模型预测最佳工艺为：60%乙醇，溶剂倍数10倍，提取3次，每次1 h。验证试验结果与预测值相比，其误差均小于5%，说明利用Box-Behnken法设计提取工艺稳定可靠，为工业化生产提供一定的参考价值。

1.崔凤侠, 章宸, 姜勇, 等. 新疆一枝蒿乙酸乙酯部位化学成分研究[J].中国中药杂志, 2013, 38(11): 1757-1759. [Cui FX, Zhang C, Jiang Y, et al. Chemical constituents from ethyl acetate extract of Artemisia rupestri[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2013, 38(11): 1757-1759.] DOI: 10.4268/cjcmm20131122.

2.张素挽, 杨璐, 顾政一, 等. 新疆一枝蒿化学成分的研究[J]. 新疆医科大学学报, 2016, 39(4): 408-410. [Zhang SW, Yang L, Gu ZY, et al. Studies on chemical constituents of Artemisia rupestris L[J]. Journal of Xin Jiang Medical University, 2016, 39(4): 408-410.] DOI: 10.3969/j.issn. 1009-5551.2016.04.006.

3.顾冬雨. LC-MS研究一枝蒿药材及制剂的化学成分和一枝蒿酮酸的代谢产物[D]. 新疆: 中国科学院大学(新疆), 2012.

4.赵宗政. 新疆一枝蒿化学成分的研究[D]. 南京: 南京大学(南京), 2012.

5.贺飞. 新疆一枝蒿化学成分及HPLC指纹谱图研究[D].新疆: 中国科学院大学(新疆), 2012.

6.Gu D, Yang Y, Chen Q, et al. Identification of metabolites of rupestonic acid inra-turine by liquid chromatography combined with electrospray ionizationquadr-upoletime-of-flight tandem mass spec-trometry[J]. Biomed Chromatogr, 2015, 29(4): 595-603. DOI: 10.1002/bmc.3319.

7.Gu D, Yang Y, Abdulla R, et al. Characterization and identification of chemical comp-ositions in the extract of Artemisia rupestris L. by liquid chromatography coup-led to quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom, 2012, 26(1): 83-100. DOI: 10.1002/rcm.5289.

8.Yang Y, Gu D, Yili A, et al. One-step separation and purification of rupestonic acid and chrysosptertin B from Artemisia rupestris L. by high-speed counter-current chromatography[J]. Phytochem Anal, 2010, 21(2): 205-209. DOI: 10.1002/pca.1169.

9.兰冬冬, 朱国强, 郭雄飞, 等. 不同生长期一枝蒿中3种化学成分的含量测定[J]. 中医药学报, 2017, 45(6): 24-27. [Lan DD, Zhu GQ, Guo XF, et al. Contents determination of three chemical constituents in Artemisia rupestris L. at different growth stages[J]. Acta Chinese Medicine and Pharmacology, 2017, 45(6): 24-27.] DOI: 10.3969/j.issn.1002-2392.2017.06.007.

10.夏少立, 曹悦, 李庆林, 等. 新疆一枝蒿的化学成分研究[J].中草药, 2020, 51(13): 3393-3398. [Xia SL, Cao Y, Li QL, et al. Chemical constituents of Artemisia rupestris[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2020, 51(13): 3393-3398.] DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670. 2020.13.005.

11.蔡晓翠, 毛艳, 贺金华, 等. 新疆一枝蒿不同极性部位体外抗炎作用的谱-效关系分析[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(9): 1580-1589. [Cai XC, Mao Y, He JH, et al. Spectrum-activity relationship of anti-inflammatory effect in vitro of different polar parts of Artemisia rupestris L[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(9): 1580-1589.] DOI:10.16155/j.0254-1793.2019.09.06

12.新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局. 新疆维吾尔自治区中药维吾尔药材饮片炮制规范, 第1册[S].2010: 283.

13.田红林, 马英, 轩辕欢, 等. HPLC测定岩蒿茎、花、叶中一枝蒿酮酸、蒙花苷、木犀草素的含量[J].中药材, 2016, 39(11): 2566-2568. [Tian HL, Ma Y, Xuan YH, et al. Determination of artesunic acid,linarin and luteolin in stems, flowers and leaves of Artemisia scoparia by HPLC[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2016, 39(11): 2566-2568.] DOI: 10.13863/j.issn1001-4454.2016.11.032.

14.陈振东, 毛艳, 顾政一, 等. 复方一枝蒿滴鼻剂提取工艺的优化[J].中成药, 2018, 40(4): 957-961. [Chen ZD, Mao Y, Gu ZY, et al. Optimization of extraction process of Compound Artemisia Rhinodrops[J]. Chinese Tradi-tional Patent Medicine, 2018, 40(4): 957-961.] DOI: 10.3969/j.issn.1001-1528.2018.04.040.

15.毛艳, 陈振东, 顾政一, 等. 多指标综合评分法优选芩蒿滴鼻剂的提取工艺[J].中国中医药信息杂志, 2018, 25(4): 82-86. [Mao Y, Chen ZD, Gu ZY, et al. Optimization of extraction technology for qinhao nasal drops by multi-index comprehen-sive evaluation method[J]. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine, 2018, 25(4): 82-86.] DOI: 10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.017.