目的  探讨沉默哺乳动物不育系20样激酶1（MST1）基因对帕金森病中多巴胺能神经元细胞作用的影响。

方法  培养PC12细胞并诱导分化为神经元，将神经元分为对照组、1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）组、MST1 SiRNA+MPP+组、MST1 SiRNA组，转染后培养48 h，采用Western blot法检测神经元细胞MST1、自噬启动蛋白1（ULK1）、核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）的蛋白表达；采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖试剂盒检测细胞内丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性。

结果  转染后，MST1 SiRNA组神经元细胞中MST1蛋白表达明显减少（P＜0.001）。与对照组相比，MPP+处理后能够明显抑制PC12细胞的增殖（P＜0.01），增加MDA含量，抑制SOD、CAT活性并降低GSH含量（P＜0.01），增加MST1和ULK1蛋白表达，抑制p-S6K1蛋白表达（P＜0.01）。与MPP+组相比，MST1 SiRNA转染后能够有效改善MPP+对PC12细胞增殖的抑制作用（P＜0.05），同时降低MDA的含量，增加GSH含量和SOD、GSH、CAT的活性（P＜0.01），降低MST1和ULK1的蛋白表达，增加p-S6K1的蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）。

结论  沉默MST1基因能够抑制氧化应激、促进细胞增殖以及发挥神经元的保护作用。

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是常见第二大神经退行性变性疾病，PD的发病率约为0.3%，60岁以上人口发病率高达1%，且随年龄的增长而升高[1]。PD患者的病理特征为黑质多巴胺能神经元变性丢失，导致患者出现静止性震颤、运动迟缓、肌肉强直以及运动障碍等症状[2-3]，其发病机制与α-突触核蛋白、氧化应激、线粒体功能障碍以及富含亮氨酸的重复激酶2（LRRK2）基因突变等因素有关[4]。目前，PD的临床治疗只能改善临床症状，但是不能逆转PD的病理进程。因此，针对发病机制进行研究就显得尤其重要。

研究[5-6]发现哺乳动物不育系20样激酶1（MST1）-Hippo信号通路在细胞凋亡及多种肿瘤发生发展中起重要作用，MST1是Hippo通路的核心成员之一，而MST1基因能被多种促凋亡刺激和细胞应激所激活，继而引起细胞凋亡。氧化应激作为PD的主要发病机制之一，MST1参与氧化应激引起的神经元凋亡[7-8]。研究[9]显示MST1 与 p53 相互作用并通过 p53 的磷酸化促进神经元凋亡，或者通过诱导促凋亡因子Bim基因表达导致神经元凋亡。MST1与神经元的关系密切，而MST1基因在PD的多巴胺能神经元的死亡中是否发挥作用尚不得知。因此，本研究旨在探讨MST1基因沉默对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）所致PC12细胞损伤的保护作用及抗氧化机制，揭示MST1基因发挥神经保护作用的相关机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

GGNOME-XRQ-NPC型Western-Blot发光成像系统（美国Gene 公司）；Thermo Multifuge X1型低温高速离心机（美国Thermo公司）；Forma 3110型CO₂培养箱（美国Thermo公司）；Tecan M1000 PRO型酶标仪（瑞士Tecan公司）；YC-280HC型医用冷藏箱（澳柯玛）。

胎牛血清（批号：10099141C）和DMEM培养基（批号：C11995500CP）购自美国Gibco公司；MPP+（批号：M0896-100MG）和噻唑蓝比色法（MTT，批号：M2003-1G）试剂购自美国Sigma公司；Trizol试剂（批号：10296010）、PCR逆转录试剂盒（批号：AM1907）和荧光定量PCR（批号：4316567）试剂盒购自美国Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号：P0012）购自广州市昊升生物科技有限公司；Lipofectamine 2000（美国Life Technologies公司，批号：11668-019）；丙二醛（MDA，批号：A003-2-1）、超氧化物歧化酶（SOD，批号：A001-3-2）、还原性谷胱甘肽（GSH，批号：A006-2-1）和过氧化氢酶（CAT，批号：A007-2-1）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；MST1（批号：3682T）、自噬启动蛋白1（ULK1，批号：4773S）抗体购自CST公司；核糖体蛋白S6激酶1（S6K1，批号：ab32529）抗体（Abcam公司）；β-acting（批号：BES-17751RB）和 HRP－山羊抗兔（批号：BES2069TSA）购自上海博尔森生物科技有限公司。

1.2 细胞

PC12细胞（广州市左克生物科技发展有限公司，批号：iCell-r024）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

将PC12细胞培养在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，培养条件设为体积分数5% CO₂、37℃，待细胞生长达到70%~80%融合时加入胰蛋白酶按1 ∶ 3传代。

1.3.2 细胞转染

转染前24 h取对数生长期的细胞，消化传代，调整密度为2×10⁵个/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL。转染时换成新鲜培养液，脂质体5 µL加人250 µL培养液稀释，MST1 SiRNA （SiRNA终浓度为50 nmol·L^-1）加入250 µL培养液稀释，室温放置5 min后，将脂质体与SiRNA混合，室温放置30 min待其形成稳定的复合物，逐滴加入细胞，每孔终体积2 mL。置于5% CO₂、37℃细胞培养箱中培养24 h后进行后续操作。

1.3.3 细胞分组

调整密度为2×10⁵个/mL，接种于6孔板中，细胞分为4组，每组设3个复孔：对照组（等量生理盐水处理24 h）、MPP+组（添加50 μmol·L^-1的MPP+孵育24 h）、MST1 SiRNA组（Lipofectamine 2000按50 nmol·L^-1浓度进行MST1 SiRNA转染）、MST1 SiRNA+MPP+组（MST1 SiRNA转染24 h后再添加50 μmol·L^-1的MPP+孵育24 h）。

1.3.4 MTT检测细胞抑制率

将PC12细胞以1×104/100 μL接种于96孔板中，按“1.3.3”项下方法进行分组，另设空白组（只加培养液）。培养24 h后去除旧的培养液，并加入180 μL新鲜培养液，再加入20 μL MTT溶液（5 μg·mL^-1），培养4 h后加入DMSO 150 μL振荡至蓝紫色结晶溶解，最后于酶标仪490 nm处检测光密度（OD）值，并计算细胞抑制率（%）：细胞抑制率=[1-（实验组平均OD值-空白组平均OD值）/（对照组平均OD值-空白组平均OD值）]×100%。

1.3.5 Western blot检测MST1、ULK1、p-S6K1、S6K1蛋白表达

细胞按“1.3.3”项下方法进行分组，用胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤后加入裂解液重悬细胞，冰浴裂解15 min，4℃条件下3 000×g 离心 10 min，收集上清液。采用BCA法检测蛋白浓度，调整各组细胞浓度，各组取40 μg蛋白样品于聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用275 mA 电流2 h 将蛋白转印至PVDF膜，用封闭液（50 g·L^-1 BSA、0.1%聚山梨醇酯-20 TBS缓冲液）封闭后，加入β-actin、MST1、ULK1、p-S6K1、S6K1抗体（1 ∶ 1 000）4℃孵育过夜；第2天加入HRP－山羊抗兔（1 ∶ 1 000）体室温孵育2 h，化学发光显影。

1.3.6 细胞MDA、GSH含量和SOD、CAT活性检测

收集各组PC12细胞接种至24孔板中，按“1.3.3”项下方法进行分组，然后收集EP管中离心后上清液。按照试剂盒说明书进行操作，检测MDA、GSH含量和SOD、CAT的活性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，实验均重复3次，数据以x±s表示，两组比较采用独立样本 t 检验，数据经正态性和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MST1 SiRNA对MST1蛋白表达影响

MST1 SiRNA转染48 h后，与对照组相比，MST1 SiRNA转染能够抑制蛋白表达（P＜0.001），说明转染效率明显。结果见图1和表1。

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  图1 MST1 SiRNA转染后的MST1蛋白条带图

  Figure 1.MST1 protein band diagram after transfection with MST1 SiRNA

  

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  表格1 MST1 SiRNA对MST1蛋白表达影响（x±s，n=3）

  Table 1.Influence of MST1 SiRNA on MST1 protein expression (x±s, n=3)

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2.2 MST1 SiRNA对PC12细胞增殖的影响

与对照组相比，MPP+处理后能够明显抑制PC12细胞的增殖（P＜0.01）；与MPP+组相比，MST1 SiRNA转染后能够有效改善MPP+对PC12细胞增殖的抑制作用（P＜0.05）；单独MST1 SiRNA处理与MST1 SiRNA+MPP+组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

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  表格2 MST1 SiRNA对PC12细胞增殖的影响 （%，x±s，n=3）

  Table 2.Effects of MST1 SiRNA on proliferation of PC12 cells (%, x±s, n=3)

  注：与对照组相比，aP＜0.01；与MPP+组相比，bP＜0.05

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2.3 MST1 SiRNA对MDA、GSH含量和SOD、CAT活性的影响

与对照组相比，MPP+处理后能够明显增加MDA表达，抑制SOD、CAT活性并降低GSH含量（P＜0.01）；与MPP+组相比，MST1 SiRNA转染后能够有效改善MPP+对MDA含量的提高作用以及对SOD、GSH、CAT活性的抑制作用（P＜0.01）；单独MST1 SiRNA处理与MST1 SiRNA+MPP+组相比，MDA和GSH含量差异无统计学意义（P＞0.05），SOD和CAT活性表达升高（P＜0.01）。结果见表3。

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  表格3 MST1 SiRNA对MDA、GSH含量和SOD、CAT活性的影响（x±s，n=3）

  Table 3.Effects of MST1 SiRNA on content of MDA, GSH and activity of SOD, CAT (x±s, n=3)

  注：与对照组相比，aP＜0.01；与MPP+组相比，bP＜0.01；与MST1 SiRNA+MPP+组相比，cP＜0.01

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2.4 MST1 SiRNA对MST1、ULK1、p-S6K1、S6K1蛋白表达的影响

与对照组相比，MPP+处理后能够明显增加MST1和ULK1蛋白表达，抑制p-S6K1蛋白表达（P＜0.01），p-S6K1/ S6K1比值也明显降低（P＜0.01）；与MPP+组相比，MST1 SiRNA转染后能够有效改善MPP+对MST1和ULK1蛋白的促进作用以及对p-S6K1蛋白的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01），p-S6K1/ S6K1比值也升高（P＜0.01）；单独MST1 SiRNA处理与MST1 SiRNA+MPP+组相比能够明显抑制MST1蛋白表达（P＜0.01）。各组之间S6K1蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图2和表4。

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  图2 MST1、ULK1、p-S6K1、S6K1蛋白条带图

  Figure 2.Protein band diagrams of MST1, ULK1, p-S6K1 and S6K1

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  表格4 MST1 SiRNA对MST1、ULK1、p-S6K1、S6K1蛋白表达的影响（x±s，n=3）

  Table 4.Effects of MST1 SiRNA on the expression of MST1, ULK1, p-S6K1 and S6K1 proteins (x±s, n=3)

  注：与对照组相比，aP＜0.01；与MPP+组相比，bP＜0.05，cP＜0.01；与MST1 SiRNA+MPP+组相比，dP＜0.01

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3 讨论

PD是以运动功能障碍为主要症状的常见神经退行性变性疾病。我国65 岁以上人群PD患病率为1.7%，目前PD患者总数超过200 万，每年新发近10 万例[10]。PD的病理基础是黑质多巴胺能神经元的变性死亡。近年来研究[11]发现，PD 中多巴胺能神经元变性死亡涉及细胞凋亡，并且氧化应激作为PD的主要发病机制之一，由于氧化应激引起的受损大分子积聚在线粒体中，细胞器的功能被破坏，导致线粒体释放细胞色素c并触发细胞凋亡，引起多巴胺能神经元死亡。MST1在多种疾病中能够调节多条不同的凋亡通路引起细胞凋亡，MST1也参与氧化应激引起的神经元凋亡[7-8]。因此，本研究以PC12细胞为模型，MPP+经多巴胺转运体能转移到多巴胺能神经元内，具有多巴胺能神经元毒性，PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞克隆的细胞株，能表达酪氨酸羟化酶并合成多巴胺，是研究多巴胺能神经元常用的细胞系。所以本研究通过MPP+刺激PC12模拟PD细胞损伤模型，通过MST1 SiRNA观察其对神经元发挥保护作用的机制。

本研究结果显示，通过MST1 SiRNA转染48 h后能够明显抑制MST1 蛋白表达，说明转染有效，细胞存活实验显示，MST1 SiRNA转染后能够明显改善MPP+引起的神经元凋亡，发挥保护作用，说明MST1 SiRNA能够抑制细胞凋亡，这与Wang等[12]研究MST1介导的神经元凋亡是阿尔茨海默症认知缺陷重要机制相一致。氧化应激是多巴胺能性神经退行性变性的主要因素之一，氧化应激通过产生过氧化物和自由基, 损伤细胞内的所有组成部分, 包括蛋白质、脂类和DNA, 从而引发病理过程。MDA为氧自由基与细胞膜内多价不饱和脂肪酸作用后所产生的一种代谢产物，常作为衡量氧化应激水平的指标，其在机体血液中的含量可准确反映组织损伤程度、机体脂质过氧化速率和强度以及组织过氧化损伤程度，该物质升高也会对细胞造成损伤[13]。本研究中MPP+诱导的神经元损伤中MDA明显升高，而MST1 SiRNA转染后能够明显降低MDA表达，抑制MPP+诱导的氧化损伤。SOD是反映人体内自由基代谢状态的重要指标之一，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其水平的高低可间接反映机体清除自由基的能力。GSH参与氧化还原反应，为脑内最重要的自由基清除系统。CAT与SOD发挥协同作用形成抗氧化体系，可有效防止氧化而伤害机体[14]。散发性和家族性PD患者的脑组织中均检测到较高水平的氧化蛋白、脂质和DNA。PD患者中活性氧（ROS）和MDA水平升高，抗氧化剂如GSH含量、CAT和SOD活性降低[15]。本研究中MST1 SiRNA转染后能够促进抗氧化酶SOD、GSH、CAT的表达，发挥抗氧化作用，降低MDA含量，抑制MPP+诱导的氧化损伤作用。

氧化应激产物和活性氮的积累与线粒体功能障碍有关，导致能量产生的缺陷、金属稳态的改变和有毒蛋白质聚集物的积累，这是PD的典型特征。最终通过细胞凋亡、坏死、铁脱落或自噬激活细胞死亡途径[12]。ULK1作为自噬反应的重要部分，通过磷酸化S317和S777激活ULK1来促进自噬，ULK1阻断S6K1在T389位点的磷酸化有助于神经退行性变，参与神经元细胞的凋亡。雷帕霉素复合物1（mTORC1）-ULK1通路通过在S757位点磷酸化抑制ULK1酶活性介导自噬的抑制途径[16]；mTORC1-S6K1通路途径也与自噬相关，并且可以促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡[17-18]；本研究显示MPP+诱导的神经元损伤中ULK1蛋白表达明显升高，p-S6K1蛋白表达明显受抑制，p-S6K1/ S6K1比值也明显降低，而MST1 SiRNA转染后能够明显抑制ULK1蛋白表达，促进p-S6K1蛋白表达，升高p-S6K1/ S6K1比值，抑制细胞的凋亡和自噬，发挥神经保护作用。

综上所述，本研究发现MST1 SiRNA在MPP+诱导的神经元损伤模型中抑制氧化应激，发挥抗氧化以及抑制ULK1蛋白表达、促进p-S6K1蛋白表达作用，促进细胞的存活，其可能的机制有待深入研究。

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