目的  研究鬼臼毒素固体脂质纳米粒（PPT-SLNs）对非小细胞肺癌A549细胞增殖和迁移的影响。

方法  采用低温乳化凝固法制备PPT-SLNs，透射电镜观察纳米粒的形态，粒径分析仪测定其粒径和电位，HPLC法测定PPT-SLNs的包封率，透析法评估PPT-SLNs体外药物缓释性能，CCK8和细胞划痕实验检测鬼臼毒素（PPT）及PPT-SLNs对A549细胞增殖和迁移能力的影响。

结果  PPT-SLNs纳米粒基本呈圆球形或椭圆球形，粒径为（44.0±21.6）nm，Zeta电位为（-15.1±3.2）mV，包封率为（85.5±2.6）%；缓释性能测定显示PPT-SLNs在模拟生理条件下（pH 7.4）的稳定性较好，在弱酸性条件下（pH 5.0）水解速度明显加快；PPT-SLNs和PPT对A549细胞增殖的抑制作用呈一定的剂量和时间依赖性，48 h浓度为5 µmol·L^-1时，PPT-SLNs对细胞增殖的抑制作用显著高于PPT [（69.60±0.62）% vs.（56.61%±4.71）%，P＜0.05]，在正常肺上皮BEAS-2B细胞中，PPT-SLNs的增殖抑制作用则显著低于PPT [（24.52±3.94）% vs.（35.07±0.47）%，P＜0.05]；细胞划痕24 h时，PPT-SLNs对A549细胞体外迁移抑制作用明显高于PPT [（17.18±2.10）% vs.（28.31±2.71）%，P＜0.01]。

结论  PPT-SLNs可增强对A549细胞增殖和迁移的抑制，且对正常肺上皮细胞的毒性更小。

肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因，其发病率呈逐年增加的趋势。虽然临床治疗取得了较大进展，但肺癌5年生存率仅为10%~13%，如何改善肺癌的治疗效果、提高肺癌患者的总生存率是亟待解决的向题[1]。由于化疗药的不良反应，许多患者往往无法耐受而放弃化疗，严重影响患者生活质量[2]。因此寻求低毒、高效的天然植物成分成为抗肿瘤研究的热点。

鬼臼毒素（podophyllotoxin , PPT）是一种从荚果植物根部分离出来的天然抗萎缩木质素荚果树脂，因其出色的药用价值而被广泛研究[3]。PPT具有显著的抗肿瘤活性，由PPT结构改造所得的衍生物依托泊苷（etoposide，VP-16）和替尼泊苷（teniposide，VM-26）作为抗肿瘤药物来治疗各种癌症，但由于其低溶解性，对健康组织缺乏特定的选择性以及可能导致一些严重不良反应，尤其是剧烈的胃肠道反应限制了其应用[4]。随着纳米载药系统在生物学及医学领域的不断发展，固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles, SLNs）作为一种新型药物载体制剂，以其良好的组织相容性和靶向缓释特性，成为肿瘤靶向治疗的研究热点[5-6]。本课题拟设计具有高度靶向性、缓释性的PPT新型制剂PPT-SLNs，并对比研究PPT和PPT-SLNs对非小细胞肺癌A549细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Zetasizer3000HS型粒径分析仪（英国Malvern公司）；85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；TMP-1 型电子天平（长沙湘仪天平仪器设备有限公司）；KQ-250DE超声波清洗器（250 W，40 KHz，昆山市超声仪器有限公司）；H-7500型透射电镜（日本日立公司）；Agilent 1200型高效液相色谱（美国Agilent公司）。

PPT（国药集团化学试剂上海有限公司，批号：20181128，纯度98%）；二甲基亚砜、聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（Sigma公司，批号：RNBK0607、MKBX3528V）；硬脂酸、卵磷脂、吐温-20和氯仿（国药集团化学试剂上海有限公司，批号：20210510、20220516、20210430、20201105）；RPMI 1640 培养基、胎牛血清、0.25%胰酶（美国Life Technologies公司，批号：8122730、42A1201K 、2492939）； CCK8试盒（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0218-Oct-11F）。

1.2 细胞

A549细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，目录号：SCSP-503）；BEAS-2B细胞（上海碧云天生物技术有限公司 ，产品编号：C6106）。

1.3 方法

1.3.1 PPT-SLNs的制备

PPT-SLNs采用低温乳化凝固法进行制备[7]：玻璃烧瓶加入200 mg 硬脂酸、100 mg 卵磷脂、50 mg PPT、10 mL氯仿，超声溶解，形成有机相；另将200 mg 聚氧烯(40)硬脂酸酯超声溶解于30 mL双蒸水中，形成水相；将有机相缓慢注入水相中，75℃水浴1 200 r·min^-1 搅拌2~3 h，使溶液浓缩至约5 mL；将所得乳液快速混于另一0~2℃的5 mL冰水中，1 200 r·min^-1继续搅拌2 h；将所得悬浮液用双蒸水以48 400×g离心清洗两次；最后将沉淀重悬于双蒸水中并超声0.5 h；在-80℃条件下冷冻4 h，并在台式冻干机中冻干，即得PPT-SLNs。空白SLNs制备不添加PPT，其余步骤与PPT-SLNs一致。

1.3.2 PPT-SLNs的形态学及稳定性观察

取PPT-SLNs混悬液加适量双蒸水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以2%磷坞酸钠进行负染并干燥，在透射电镜下观察粒径大小、形态并拍照；取PPT-SLNs及空白SLNs混悬液各10份，其中5份放置于室温，另外5份放置于４℃冰箱内，观察24 h、１周、1个月、3个月、6个月的外观变化，有无分层。

1.3.3 PPT-SLNs粒径分布和Zeta电位测定

取PPT-SLNs混悬液1 µL，加适量双蒸水稀释，测定PPT-SLNs混悬液的粒径分布和Zeta电位。

1.3.4 PPT-SLNs的包封率测定

取PPT-SLNs混悬液适量，13 523×g离心30 min，上清液经0.22 µm滤膜滤过；精密量取滤液1 mL加甲醇定容至10 mL，采用HPLC法[8]测定PPT含量：色谱柱：ODS-C₁₈（250 mm× 4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（59 ∶ 41 ∶ 0.6）；流速：1 mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：291 nm；进样量：20 µL。计算PPT-SLNs的包封率(%)，公式为(C_总-C_测)/C_总×100%，式中C_总为加入的药物量，C_测为上清液中测得的药物量。

1.3.5 PPT-SLNs的体外药物缓释性能测定

称取50 mg的PPT-SLNs复合材料置入处理后的透析袋中，并注入4~5 mL PBS。将透析袋放入装有200 mL 不同pH（7.4，5.0）PBS的烧杯中，于37 ℃水浴以100 r·min^-1转速进行搅拌。按一定时间间隔从瓶内移取PPT-SLNs溶液2 mL，同时补充等体积的PBS，取20 µL PPT-SLNs溶液采用HPLC法检测，根据峰面积计算不同时间点PPT的浓度，并绘制释放曲线。

1.3.6 CCK8检测细胞增殖

取对数生长期A549和BEAS-2B细胞，消化后调整细胞浓度为2×10³个/mL接种到96孔板中，每孔100 µL，细胞贴壁后更换培养液，分为对照组、不同浓度的PPT组和PPT-SLNs组（0.005，0.05，0.5，5，10，15，20 µmol·L^-1），分别处理细胞24 h和48 h，每组设置4个复孔，每孔加入10 µL CCK8试剂，继续培养2 h。用酶标仪测定450 nm波长下的光密度（OD）值，并计算细胞存活率(%)，公式为(处理组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.7 细胞划痕实验检测细胞迁移

将A549细胞接种于6孔板中，1.5×10⁶个细胞孔，对照组、PPT组、PPT-SLNs组各铺3孔，培养过夜。实验当天用200 µL枪头垂直在细胞层中划痕，用无菌PBS将脱落的细胞冲洗干净，进行0 h拍照并记录划痕的宽度，24 h后根据记录位置再次拍照，计算细胞迁移率(%)，公式为(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.4 统计学分析

采用Graphpad Prism 7.0和SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPT-SLNs的形态学及稳定性观察

制备的PPT-SLNs混悬液为质地均一、带银白色金属光泽的半透明胶体，电镜下PPT-SLNs基本呈圆球状或椭圆球状，见图1。放置于4℃冰箱内的样本，6个月内无絮状物、沉淀及药物结晶析出。放置于室温的样本，3个月内无絮状物、沉淀及药物结晶析出，但6个月时部分样本出现少量沉淀及分层，振荡后立即恢复均一外观。

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  图1 SLNs和PPT-SLNs的透射电镜图

  Figure 1.Transmission electron micrographs of SLNs and PPT-SLNs

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2.2 PPT-SLNs粒径分布和Zeta电位

PPT-SLNs粒径为（44.0±21.6）nm，分布较均匀，Zeta电位为（-15.1±3.2）mV，见图2和图3。

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  图2 PPT-SLNs粒径分布

  Figure 2.Diameter graph of particles of PPT-SLNs

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  图3 PPT-SLNs Zeta电位

  Figure 3.Zeta potential of PPT-SLNs

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2.3 PPT纳米粒包封率

测得PPT-SLNs混悬液中PPT的平均包封率为（85.5±2.6）%。

2.4 PPT纳米粒体外释放率

孵化48 h后，PPT-SLNs在PBS（pH 7.4）中释放的游离PPT为（22.6±0.6）%，表明脂质体纳米粒在模拟生理条件下的稳定性较好。在弱酸性的环境下（pH 5.0）PPT-SLNs的水解速度明显加快，游离药物PPT的释放增加到（76.3±0.9）%。由此可见PPT-SLNs具有一定pH控释能力，在体内酸性环境下有效解离并持续释放PPT。见图4。

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  图4 PPT-SLNs在不同条件下的药物释放率（n=3）

  Figure 4.Podophyllotoxin release rate of PPT-SLNs under different conditions (n=3)

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2.5 PPT-SLNs对A549和BEAS-2B细胞增殖的抑制作用

以不同浓度PPT-SLNs和PPT处理细胞24 h和48 h后，在相同浓度下对PPT-SLNs和PPT的细胞增殖抑制进行比较，发现24 h浓度为0.005 µmol·L^-1时，PPT-SLNs和PPT对A549和BEAS-2B细胞增殖影响均较小，两者间差异无统计学意义（P＞0.05）；48 h浓度为5 µmol·L^-1时，PPT-SLNs对A549细胞增殖的抑制作用显著高于PPT [（69.60±0.62）% vs.（56.61±4.71）%， P=0.02]；而在正常肺上皮BEAS-2B细胞中，PPT-SLNs的增殖抑制作用则显著低于PPT [（24.52±3.94)% vs.（35.07±0.47）%，P=0.03]。见图5。

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  图5 不同浓度与时间处理的PPT和PPT-SLNs对A549和BEAS-2B细胞增殖的影响（n=4）

  Figure 5.Effects of different concentrations and time treatments of PPT and PPT-SLNs on the proliferation of A549 and BEAS-2B cells (n=4)

  注：与PPT组比较，aP<0.05，bP<0.01

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2.6 PPT-SLNs对A549细胞迁移的抑制作用

PPT-SLNs药物半抑制浓度（IC₅₀）为2.53 µmol·L^-1，以该浓度作为干预浓度，检测PPT-SLNs和PPT对细胞迁移能力的影响。在细胞划痕24 h时，PPT-SLNs对A549细胞体外迁移抑制作用明显，其细胞迁移率低于PPT组[（17.18±2.10）% vs.（28.31±2.71）%，P=0.005]。见图6。

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  图6 PPT和PPT-SLNs对A549细胞迁移能力影响（n=4）

  Figure 6.Effect of PPT and PPT-SLNs on the migration ability of A549 cells (n=4)

  注：与PPT组比较，aP<0.01

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3 讨论

PPT显著的抗癌能力使其成为发现各种新型抗肿瘤药物的先导化合物，但也因其较差的水溶性以及可能导致的严重不良反应，在癌症治疗中的临床应用一直受到限制。据报道，PPT治疗可能导致不良事件，特别是胃肠道反应和血液学毒性，包括继发性中性粒细胞减少症、白血病和骨髓增生症[9]。

在过去的几十年里，各种纳米药物递送系统已经被开发出来，以提高水溶性差的药物疗效，包括脂质体、纳米乳剂、高分子纳米颗粒和一些无机材料。这些纳米载体与游离药物相比，表现出较小的全身毒性，主要是由于通过增强渗透性和滞留效应带来了更好的靶向性。其中，脂质体药物载体在癌症治疗中引起了广泛关注[10]。脂质体是一种理想的药物剂型，具有无毒性、兼容性、靶向性、缓释性的特点，纳米脂质体可有效解决用药依存性和溶解性问题，改善稳定性和生物利用度，在肿瘤病灶堆积释放达到定向给药作用，为解决PPT临床应用的难题提供了希望。

研究[12]发现PPT-SLNs可增强其对人白血病多药耐药细胞株K562/ADM 细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用，部分逆转其耐药性[11]；PPT-SLNs可通过内质网应激途径诱导永生化人阴道上皮细胞VK2/E6E7细胞的凋亡。史毓杰等[13]在Hela细胞中的研究发现PPT-SLNs具有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用，并呈时间和浓度的依赖性，在相同浓度处理下的PPT-SLNs较PPT有更强的细胞增殖与迁移抑制作用。本实验通过制备PPT-SLNs，以非小细胞肺癌A549细胞为靶细胞，研究PPT-SLNs对肺癌细胞的抗增殖和迁移作用。以浓度梯度的PPT-SLNs和PPT处理A549细胞后，发现其对细胞增殖抑制作用呈一定浓度和时间的依赖性。低浓度时PPT-SLNs与PPT对A549的增殖抑制作用差异不明显，甚至PPT比PPT-SLNs作用略强，但高浓度时，PPT对细胞的增殖抑制进入了平台期，PPT-SLNs的增殖抑制作用显著强于PPT。这可能与SLNs包封后药物对细胞的粘附性更大，更容易附着到细胞表面有关，同时由于以脂质体为载体的药物更容易通过胞饮或膜融合的方式进入细胞，提高了A549细胞对PPT的摄取，使PPT-SLNs处理组细胞内的有效作用浓度大于PPT组。本课题组还以正常肺上皮BEAS-2B细胞为研究对象，观察了PPT-SLNs对正常细胞的毒性影响，发现与PPT相比，PPT-SLNs不仅对肺癌细胞杀伤力更强，同时对正常肺上皮细胞的毒性影响更小，且SLNs还具有药物缓释作用，使药物对细胞的抑制作用更为持久。本实验研究结果与Zhu等[8]的研究一致，其发现PPT-SLNs对宫颈癌HeLa细胞表现出较高的细胞毒性，而对人肾上皮293 T细胞表现出较低的细胞毒性，这可能与PPT-SLNs和PPT的细胞摄取不同相关，PPT-SLNs在肿瘤细胞中的摄取要显著大于正常细胞。

本研究提示PPT-SLNs作为一种抗肿瘤药物的新型制剂对肺癌细胞表现出较好的增殖与迁移抑制作用，今后的研究中将进一步在体内外验证PPT-SLNs对其他肺癌细胞的作用及机制，为临床应用提供理论依据和实验基础。

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