目的  研究肺癌上皮间质转化（EMT）对铁死亡药物敏感性的影响。

方法  利用生物信息学分析EMT相关基因与多种药物治疗敏感性的相关性；利用流式细胞分选出E-钙黏蛋白低表达且N-钙黏蛋白高表达、E-钙黏蛋白高表达且N-钙黏蛋白低表达的细胞，进而模拟肺癌间质细胞和上皮细胞；通过铁死亡诱导剂（谷胱甘肽过氧化物酶4抑制剂）和内源性铁死亡诱导剂（干扰素γ联合花生四烯酸）处理肺癌细胞，检测比较不同类型肺癌细胞对铁死亡的敏感性。

结果  细胞对铁死亡的耐受程度与E-钙黏蛋白的表达呈正相关，与波形蛋白、锌指结构E-box-结合同源框1、锌指结构E-box-结合同源框2的表达呈负相关。铁死亡药物处理结果显示E-钙黏蛋白低表达且N-钙黏蛋白高表达的细胞对铁死亡药物具有更高的敏感性，并且可以通过铁死亡抑制剂铁抑素-1挽救干扰素γ联合花生四烯酸对细胞铁死亡的诱导作用。

结论  发生EMT的肺癌细胞对铁死亡更加敏感，铁死亡有望成为应对转移和治疗抵抗性肺癌的新策略。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一种细胞表型转化的过程，是指上皮细胞向间充质细胞的转化。在EMT发生过程中，上皮细胞标志物会降低（如由CDH1基因编码的E-钙黏蛋白），和（或）间质标志物增加（由CDH2基因编码的N-钙黏蛋白和VIM基因编码的波形蛋白）[1]。EMT与肺癌的转移、侵袭和耐药（包括化疗和免疫治疗）等密切相关 [2-4]，被认为是肿瘤发生和进展的重要机制之一，因此，靶向EMT可能成为癌症治疗的重要策略。

铁死亡是2012年报道发现的一种铁依赖性的非凋亡性细胞死亡形式[5]，是由铁离子、活性氧和含有多不饱和脂肪酸链的磷脂之间的反应引起的新型程序性细胞死亡过程[6]。诱导细胞发生铁死亡被认为是应对肿瘤治疗抵抗的新策略[7]。细胞对铁死亡的敏感性高度依赖于细胞代谢状态，尤其是脂类、铁离子和氨基酸的代谢[8]。此外，肿瘤细胞在发生EMT转变后通常会对各种治疗方法产生耐药性，但可能对铁死亡具有较高的敏感性[9-11]。基于此，本研究探讨了肺癌细胞中EMT现象与铁死亡药物敏感性之间的关联性，以期为肺癌的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Sorvall Micro 17/17R微量离心机、NanoDrop One超微量分光光度计、1300生物安全柜、HERA cell 150细胞培养孵箱购自美国Thermo Fisher Scientific；L2-6K台式低速离心机购自湖南可成仪器设备有限公司；IC1000细胞计数仪购自中国Countstar； S1000 Thermal Cycler PCR仪、CFX Connect PCR仪购自美国Bio-Rad；FACSAria 系列流式细胞分选仪购自美国BD；Alliance Q9化学发光凝胶成像仪购自英国Uvitec。

RPMI Medium Modified细胞培养基（货号：C11875500BT）、0.25%胰酶（货号：25200-072）、胎牛血清（货号：A3160802）购自美国Gibico；Eastep总RNA提取试剂盒（货号：LS1040）购自上海Promega；逆转录试剂盒（货号：RR047A）购自日本TaKaRa；(1S, 3R)-RSL3（货号：HY-100218A）、花生四烯酸（货号：HY-109590）、干扰素γ（IFN-γ，货号：HY-P7025）、铁抑素-1（Fer-1，货号：HY-100579）购自美国MCE；CCK8试剂盒（货号：CK04）购自日本Dojindo；细胞染色缓冲液（货号：420201）、人TruStain FcX™抗体（货号：101319）、E-钙黏蛋白抗体（货号：324103）、N-钙黏蛋白抗体（货号：350807）购自美国BioLegend；RIPA裂解液（货号：P0013B）、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（货号：P1045）、5×SDS上样缓冲液（货号：P0015L）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔lgG（货号：A0208）购自中国碧云天；10×TBST缓冲液（货号：T1081）购自中国solarbio ；PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%，货号：PG212）购自中国雅酶；PVDF膜（货号：ISEQ00010）购自美国Bio-Rad；谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）一抗抗体（货号：125066）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗抗体（货号：181602）购自英国Abcam；超敏ECL发光底物（货号：BOLI001）购自中国佰欧乐基；PCR引物序列由上海生工合成。

1.2 细胞

肺癌细胞株A549（中国科学院细胞库，目录号：TCHu150）。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析

根据基因集癌症分析平台（GSCA，http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/）综合分析EMT相关基因集与多种药物耐药性之间的关系；根据癌症治疗反应门户（CTRP，https://portals.broadinstitute.org/ctrp/）分析上皮标志物CDH1和间质标志物CDH2与对铁死亡诱导剂（ML162、ML210和RSL3）的耐药性的相关性。

1.3.2 细胞培养

A549细胞株在RPMI-1640培养液中培养，胎牛血清的含量为10%。细胞培养箱条件设置为37℃、5% CO2。待细胞培养至对数生长期时，进行后续相应实验。

1.3.3 细胞总RNA 提取及实时荧光定量PCR

根据Eastep总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，采用分光光度仪对获得的RNA进行定量及纯度鉴定。参照PrimeScript RT试剂盒的说明书，取1 μg RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行qPCR扩增。CDH1上游引物序列为5'-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3'，下游引物序列为5'- TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3'；CDH2上游引物序列为5'- CCTCCAGAGTTTAC TGCCATGAC-3'，下游引物序列为5'- GTAGGATC TCCGCCACTGATTC-3'； VIM上游引物序列为5'- AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA-3'，下游引物序列为5'- ATCTGGCGTTCCAGGGACTCAT-3'；内参基因β-actin上游引物序列为5'- CCACGAAAC TACCTTCAACTCC-3',下游引物序列为5'- GTGA TCTCCTTCTGCATCCTGT-3'。采用2-ΔΔCt法计算各目的基因mRNA相对表达量。

1.3.4 流式细胞分选

首先收集5×106个A549细胞，加入2 mL细胞染色缓冲液洗涤，350×g离心5 min后弃上清；500 μL细胞染色缓冲液重悬，在室温条件下于每100 μL细胞悬液中加入5 μL 人TruStain FcX™孵育10 min，阻断Fc受体；然后每100 μL细胞悬液中分别加入5 μL E-钙黏蛋白抗体和N-钙黏蛋白抗体，并在冰上避光孵育20 min进行细胞表面蛋白染色；最后加入2 mL 细胞染色缓冲液，350×g离心5 min，洗涤细胞两次，即可进行流式细胞分选。

1.3.5 耐药实验

将细胞铺板至96孔板，每孔3×103个细胞；37℃孵育24 h后，在铁死亡耐药检测实验中，用铁死亡诱导剂RSL3（0，2，4 μmol·L^-1）和不同浓度花生四烯酸（0，100，200 μmol·L^-1）＋IFN-γ（80 ng·mL^-1）处理细胞；在铁死亡耐药挽救实验中，用IFN-γ（80 ng·mL^-1）、花生四烯酸（100 μmol·L^-1）、花生四烯酸（100 μmol·L^-1）＋IFN-γ（80 ng·mL^-1）+Fer-1（20 μmol·L^-1）处理细胞。72 h后，加入CCK-8试剂37℃孵育90 min检测光密度（OD）值，并计算细胞相对存活率（%），公式为实验组OD值/对照组OD值×100%。每组设立3个复孔。

1.3.6 蛋白免疫印迹

RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按照50 ∶ 1 ∶ 1的比例制备蛋白裂解液，混匀后冰上裂解细胞30 min，4℃条件下 13 000×g离心20 min后，取上清与适量5×SDS上样缓冲液混匀于100℃煮沸10 min；配置10% SDS-PAGE分离胶，泳道中加入蛋白样，80 V电泳30 min，150 V电泳50 min；230 mA转膜95 min将蛋白转至PVDF膜；5% 脱脂奶粉室温封闭1 h ；一抗（GAPDH抗体、GPX4抗体均1 ∶ 1 000稀释）4℃过夜孵育；次日TBST室温洗膜3次，每次5 min；室温孵育二抗（1 ∶ 10 000稀释）1 h；TBST室温洗膜3次，每次5 min；借助ECL发光液使蛋白条带在化学发光凝胶成像仪中显影；Image J软件对所得图片进行灰度分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示，两组间的比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，事后检验采用多重比较的Tukey法。采用皮尔逊（Pearson）相关分析基因表达与铁死亡药物抵抗性之间的相关性。检验水准为α=0.05，所有检验均采用双侧检验。

2 结果

2.1 细胞对铁死亡诱导剂的敏感性与EMT相关

通过GSCA数据库综合分析了EMT相关基因[包括上皮标志物CDH1、间质标志物CDH2和VIM、EMT转录因子锌指结构E-box-结合同源框1（ZEB1）和锌指结构E-box-结合同源框2（ZEB2）]与多种药物抵抗性的相关性，结果发现EMT相关基因集与多种铁死亡诱导剂（ML162、ML210和RSL3）耐药性密切相关：细胞对铁死亡的耐受程度与CDH1的表达呈正相关，与VIM、ZEB1和ZEB2的表达呈负相关（图1-A）。

CDH1和CDH2同属于钙依赖性细胞黏附家族分子，分别编码E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白，在EMT过程中分别作为上皮细胞和间质细胞的标志物[12]。进一步通过CTRP具体分析了CDH1和CDH2与铁死亡诱导剂RSL3、ML210和ML162之间的相关性，并通过皮尔逊（Pearson）相关系数进一步说明了在多种肿瘤中，CDH1的表达与对铁死亡药物抵抗性呈正相关，CDH2的表达与对铁死亡药物抵抗性呈负相关（图1-B和1-C）。以上结果提示，在EMT过程中，上皮细胞对铁死亡诱导剂更耐受，而间质细胞对铁死亡诱导剂更敏感。

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  图1 EMT与铁死亡的相关性

  Figure 1.The relationship between EMT and ferroptosis

  注：A为在GSCA中，EMT相关基因与多种药物抵抗性的相关性； B为在CTRP中，CDH1的表达与对铁死亡诱导剂ML162、ML210和RSL3抵抗性的相关性；C为在CTRP中，CDH2的表达与对铁死亡诱导剂ML162、ML210和RSL3抵抗性的相关性；Pearson相关系数表示两者之间的相关程度；GEX（gene expression）表示基因表达量；AUC（area under curve）为每个化合物与肿瘤细胞系间浓度-反应曲线下面积

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2.2 间质化表型细胞对铁死亡诱导剂更敏感

为了验证发生EMT的肺癌细胞对铁死亡诱导剂更敏感，采用流式分选出肺癌细胞株A549中E-钙黏蛋白低表达且N-钙黏蛋白高表达（称为A549-E_低N_高）和E-钙黏蛋白高表达且N-钙黏蛋白低表达（称为A549-E_高N_低）细胞（图2-A），分别模拟肺癌间质细胞和上皮细胞。通过qRT-PCR验证了A549-E_低N_高细胞表达更低的CDH1，和更高的CDH2和VIM，差异有统计学意义（P＜0.05），提示细胞分选成功（图2-B）。接下来，利用不同浓度铁死亡诱导剂RSL3（0，2，4 μmol·L^-1）处理A549-E_低N_高和A549-E_高N_低细胞，结果发现，A549-E_低N_高细胞表现出对铁死亡诱导剂更高的敏感性，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2-C）。进一步通过蛋白免疫印迹实验检测了A549-E_低N_高和A549-E_高N_低细胞中GPX4蛋白的丰度，电泳条带灰度分析后显示A549-E_低N_高细胞中GPX4条带灰度更低，提示A549-E_低N_高细胞较A549-E_高N_低细胞表达更低水平的GPX4蛋白（图2-D）。以上结果表明具有间质化表型的肺癌细胞对铁死亡诱导剂更加敏感，提示EMT转化后的肿瘤细胞对铁死亡的抵抗性减弱。

• 
  图2 间质化表型细胞对铁死亡诱导剂更敏感

  Figure 2.Mesenchymal cells are more sensitive to ferroptosis inducers

  注：A为流式分选出A549-E低N高（右下）和A549-E高N低（左上）细胞；B为实时荧光定量PCR实验验证A549-E低N高和A549-E高N低细胞中CDH1、CDH2和VIM的表达水平，采用独立样本t检验，aP＜0.05；C为不同浓度RSL3处理A549-E低N高和A549-E高N低的细胞活力，A549-E低N高与A549-E高N低比较，采用独立样本t检验，aP＜0.05；D为蛋白免疫印迹实验，通过条带灰度反映A549-E高N低和A549-E低N高细胞的GPX4蛋白丰度的高低，A549-E低N高与A549-E高N低比较，GPX4条带灰度更低，GAPDH为内参

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2.3 间质化表型细胞对IFN-γ联合花生四烯酸诱导的铁死亡更敏感

为探究A549-E_低N_高细胞是否对IFN-γ联合花生四烯酸诱导肿瘤细胞发生由长链脂酰辅酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase，ACSL4）介导的免疫原性铁死亡[13]同样更敏感，利用IFN-γ联合不同浓度花生四烯酸分别处理A549-E_低N_高和A549-E_高N_低细胞，结果如预期一样，A549-E_低N_高细胞对铁死亡更敏感，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3-A）。并且通过铁死亡抑制剂Fer-1成功挽救了IFN-γ联合花生四烯酸对A549-E_低N_高细胞的铁死亡诱导作用，差异有统计学意义（P＜0.05），进而说明IFN-γ联合花生四烯酸是通过铁死亡的方式杀伤了A549细胞（图3-B）。以上结果表明，具有间质化表型的细胞对免疫原性铁死亡也更加敏感。

• 
  图3 间质化表型细胞对IFN-γ联合花生四烯酸诱导的铁死亡具有高敏感性

  Figure 3.Mesenchymal cells are highly sensitive to IFN-γ combined with arachidonic acid

  注：AA为花生四烯酸；A为不同浓度花生四烯酸（0，100，200 μmol·L-1）联合IFN-γ（80 ng·mL-1）处理A549-E低N高和A549-E高N低的细胞活力，采用独立样本t检验，A549-E低N高与A549-E高N低比较，aP＜0.05；B为IFN-γ（80 ng·mL-1）、花生四烯酸（100 μmol·L-1）、花生四烯酸（100 μmol·L-1）＋IFN-γ（80 ng·mL-1）、花生四烯酸（100 μmol·L-1）＋IFN-γ（80 ng·mL-1）＋Fer-1（20 μmol·L-1）处理A549-E低N高的细胞活力，采用单因素方差分析，与对照组比较，bP＜0.05；与花生四烯酸＋IFN-γ＋Fer-1组比较，cP＜0.05

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3 讨论

本研究通过生信分析发现发生EMT的肿瘤对铁死亡药物的敏感性更高。为了验证这一观点，本课题组通过流式细胞分选出了E-钙黏蛋白低表达且N-钙黏蛋白高表达、E-钙黏蛋白高表达且N-钙黏蛋白低表达的细胞，分别模拟间质细胞和上皮细胞，并在发现间质细胞（E-钙黏蛋白低表达且N-钙黏蛋白高表达）表现出了对铁死亡（包括RSL3、IFN-γ联合花生四烯酸）更高的敏感性。本研究证明了发生EMT的肺癌细胞对铁死亡更加敏感，为靶向EMT的临床治疗提供了新的策略。

肺癌的发生可能受到多种内在因素及外在因素的综合诱导，伴随着一系列基因的表达失控，进而导致肺癌的恶性进展[14]。由于早期临床症状不明显且缺乏早期的诊断方法，肺腺癌的确诊往往处于中晚期。多数中晚期转移性肺癌患者容易对多种治疗方案产生耐药[3]，尽管目前关于多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂安罗替尼的临床研究已经取得一定进展[15]，利用信迪利单抗联合化疗的治疗方案[16]，能显著提高晚期肺癌患者控制率，但是治疗成本相对较高。EMT已被确定为肿瘤发生和进展的主要因素之一，其赋予癌细胞转移特性（增强移动性、侵袭性）、干细胞特性，以及治疗耐药性[17]。在癌症进展或凋亡刺激（包括治疗性）条件下，上皮来源的肿瘤细胞发生EMT转变，改变肿瘤细胞特征（如细胞极性和细胞间连接的改变），并增加间充质标志物（如N-钙黏蛋白和波形蛋白）的表达[18-19]。EMT不仅促使肺癌细胞发生转移和侵袭，更赋予肺癌细胞更强的治疗抵抗，如化疗抵抗和靶向治疗抵抗[20]。因此，靶向EMT可能为转移性和治疗抵抗性肺癌患者的治疗提供新的策略。本研究首先通过生信分析发现了EMT相关基因集的表达与几种铁死亡诱导剂的敏感性具有相关性，上皮标志物基因CDH1的表达与铁死亡诱导剂的耐药性呈正相关，间质标志物基因CDH2、VIM、EMT转录因子ZEB1和ZEB2的表达与铁死亡诱导剂的耐药性呈负相关，均提示了发生上皮间质化的细胞可能对铁死亡诱导剂更敏感。

铁死亡是一种由脂质过氧化引起的新型细胞程序性死亡，本质是细胞内脂质氧化物的代谢障碍，进而在铁离子的催化下异常代谢，发生大量脂质过氧化，破坏细胞内氧化还原平衡，攻击生物大分子，触发细胞死亡[21]。诱发细胞铁死亡被认为是一种有前景的肿瘤治疗策略[22-23]。研究[9]表明，EMT会促使肿瘤细胞发生治疗抵抗成为难治性肿瘤；然而，发生EMT也会表现出对铁死亡的易感性。当癌细胞在EMT过程中失去上皮表型并获得间充质特性时，会伴随着多不饱和脂肪酸合成和新陈代谢的增加，从而促进炎性浸润并导致更多的脂质过氧化物。多不饱和脂肪酸的过氧化增加使这些癌细胞容易受到铁死亡的影响[24]。这一代谢过程发生在大多数肿瘤中，目前已报道在头颈部肿瘤[25]、黑色素瘤[26]、胰腺癌[27]、恶性间皮瘤[28]、结直肠癌[29]和乳腺癌[30]中发生EMT的同时具有对铁死亡的易感性。如在黑色素瘤中EMT转录因子ZEB1促进癌症转移，并通过调节细胞脂质代谢促进了癌细胞对靶向GPX4的铁死亡诱导剂的敏感性[10]。在恶性间皮瘤的上皮细胞中，E-钙黏蛋白介导的细胞间相互作用抑制EMT，但通过细胞内Merlin-Hippo信号通路抑制了肿瘤细胞对铁死亡的敏感性[28]。本研究利用A549肺腺癌细胞株作为模型，流式分选出E-钙黏蛋白低表达且N-钙黏蛋白高表达和E-钙黏蛋白高表达且N-钙黏蛋白低表达的细胞，证明了E-钙黏蛋白更低表达和N-钙黏蛋白更高表达的细胞对铁死亡诱导剂RSL3的敏感性更高，说明了间质细胞具有更高的铁死亡敏感性。

IFN-γ是一种重要的细胞因子，可以通过激活免疫系统，增强细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的活性，发挥抗肿瘤、免疫调节和抗病毒等作用，从而抑制肿瘤生长和扩散。IFN-γ还可以通过抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞分化等机制发挥抗肿瘤作用[31]。花生四烯酸是一种多不饱和脂肪酸，是人体必需脂肪酸之一。其是一种重要的信号分子，在调节细胞生长和肿瘤发生中具有重要作用，可以通过多种机制发挥抗肿瘤作用[32]。首先，花生四烯酸可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，从而抑制肿瘤的生长和转移。其次，花生四烯酸可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而使肿瘤细胞死亡。此外，花生四烯酸还可以抑制肿瘤细胞的血管生成和转移，从而减少肿瘤的血液供应，使其生长受限。近来研究表明，IFN-γ联合花生四烯酸可以发挥协同作用，诱导肿瘤细胞发生由ACSL4介导的免疫原性铁死亡，显著增强其抗肿瘤效果[13]。IFN-γ有较强的免疫调节功能，能抑制滑膜纤维母细胞，目前临床上已应用于类风湿关节炎患者且得到了较好的疗效；而花生四烯酸是一种人体内源性必需脂肪酸。本课题组证明了IFN-γ联合花生四烯酸增强了E-钙黏蛋白低表达且N-钙黏蛋白高表达细胞的铁死亡敏感性，提示IFN-γ联合花生四烯酸有望成为EMT转变的肿瘤细胞的潜在治疗策略。

综上所述，本研究证明了发生EMT的肺癌细胞对铁死亡更加敏感，为应对EMT引起的肺癌转移以及治疗抵抗提供了新的治疗策略。

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