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芪蓉润肠口服液HPLC-QAMS多指标成分定量控制联合化学计量学的综合质量评价研究

更新时间:2023年04月27日阅读:591次 下载:184次 下载 手机版

作者: 冯晓川 1 徐延昭 2 张静 1 张蕊 1

作者单位: 1. 北京积水潭医院中药房(北京 100035) 2. 中国食品药品检定研究院(北京 100050)

关键词: 高效液相色谱一测多评法 芪蓉润肠口服液 相对校正因子 综合质量评价 化学计量学 多指标成分 定量控制

DOI: 10.19960/j.issn.1005-0698.202304006

基金项目: 北京市中医管理局第二批中药骨干人才培养项目(京中医科字[2018]213号)

引用格式: 冯晓川, 徐延昭, 张静, 张 蕊.芪蓉润肠口服液 HPLC-QAMS 多指标成分定量控制联合化学计量学的综合质量评价研究[J]. 药物流行病学杂志,2023, 32(4): 404-416.DOI: 10.19960/j.issn.1005-0698.202304006.

Xiao-Chuan FENG, Yan-Zhao XU, Jing ZHANG, Rui ZHANG, Comprehensive quality evaluation of Qirong Runchang oral liquid based on HPLC-QAMS quantitative control of multi-components and chemometrics analysis,2023, 32(4): 404-416.DOI: 10.19960/j.issn.1005-0698.202304006.[Article in Chinese]

摘要| Abstract

目的  建立高效液相色谱一测多评法(HPLC-QAMS)多指标成分定量控制与化学计量学相结合的芪蓉润肠口服液综合质量评价方法。

方法  以毛蕊花糖苷为内参物,建立其与其他9种成分的相对校正因子,采用外标法和HPLC-QAMS法计算各成分含量并对检验结果进行对比,验证所建立的HPLC-QAMS法准确性和可行性,再运用化学计量学方法对HPLC-QAMS法检测结果进行聚类分析、主成分分析和偏最小二乘法-判别分析,建立芪蓉润肠口服液综合质量评价方法。

结果  芪蓉润肠口服液中10种定量控制指标成分线性关系良好(r>0.9990);平均加样回收率在96.92%~100.11%之间 (RSD<2.0%);两种方法所测得各成分含量差异无统计学意义(P>0.05);聚类分析结果显示12批样品聚成3类;主成分分析和偏最小二乘法-判别分析显示松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、白术内酯Ⅲ、管花苷A和毛蕊花糖苷是影响不同批次芪蓉润肠口服液样品差异性的主要标记物。

结论  所建立的HPLC-QAMS多指标成分定量控制联合化学计量的综合质量评价方法结果准确、重复性和稳定性好,可用于芪蓉润肠口服液的质量控制。

全文| Full-text

芪蓉润肠口服液由炙黄芪、肉苁蓉、地黄、玄参、白术等15味中药材加工而成,主要用于气阴两虚、脾肾不足、大肠失于濡润引起的虚证便秘,同时还能降低化疗后便秘的发生率[1],可以促进小肠运动,提高结肠的蠕动能力,增加肠管容积,缩短患者排便的时间,增加排便次数,有效改善患者便秘症状[2],还可以从根本上对抗阿片类药物引起的大便干结、变硬[3],能有效控制肛肠术后患者的排便次数,减少腹泻的风险[4]。芪蓉润肠口服液为中药复方制剂,疗效显著,原有质量标准仅采用紫外分光光度法测定了黄芪中黄芪甲苷的含量,未对其他药材进行定量控制[5]。有文献对该制剂中肉苁蓉所含松果菊苷和毛蕊花糖苷进行了定量分析[6],但芪蓉润肠口服液组方较复杂,1~2种成分的定量分析不能表征产品的内在质量。方中黄芪益气补中;肉苁蓉补肾阳、益精血、润肠通便;两者共同起到健脾益肾通便的作用,为君药。白术健脾益气、燥湿利水;太子参益气健脾;两者助君药加强益气润肠通便的作用,共为臣药。地黄清热凉血、养阴生津;玄参滋阴降火、解毒散结;麦冬养阴生津;当归补血活血、润肠通便;黄精补气养阴、健脾益肾;郁李仁润肠通便、下气利水;火麻仁润肠通便;黑芝麻补肝肾、润肠燥;桑葚补血滋阴、生津止渴;枳壳理气行滞;共为佐药。蜂蜜补中润燥、止痛解毒,为使药。全方具有益气养阴、健脾滋肾、润肠通便的功效。本试验以君药黄芪和肉苁蓉、臣药白术及佐药地黄和玄参为研究对象,对黄芪所含主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素,肉苁蓉所含主要成分松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷,地黄所含主要成分松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷,玄参所含主要成分毛蕊花糖苷,白术所含主要活性成分白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ采用高效液相色谱一测多评法(HPLC-QAMS)进行了同步定量检测,并对测得数据运用统计软件进行聚类分析和主成分分析,以期为芪蓉润肠口服液多指标质量评价模式提供科学便捷的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国ThermoFisher Scientific公司);液相色谱柱Thermo BDS C18、Capcell C18和Hedera C18(规格均为4.6 mm×250 mm,5 μm);Mettler XS105DU型电子分析天平(梅特勒托利多公司);KQ-250DBG型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品:毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ(中国食品药品检定研究院,批号分别为111920-201907、111530-201914、111978-201501、111975-201501,纯度依次为96.8%,95.2%,99.9%,99.9%);芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A和异毛蕊花糖苷(成都普瑞法科技开发有限公司,批号分别为PRF9060501、PRF8062601、PRF8091225、PRF8092503、PRF9091721、PRF9010243,纯度依次为99.6%,99.6%,99.9%,98.3%,98.9%,97.0%)。乙腈(色谱级,天津大茂化学试剂厂),娃哈哈纯净水,其余试剂为分析纯。芪蓉润肠口服液(北京北卫药业有限责任公司,每支装20 mL,批号:20210333、20210435、20210632、20210633、20210933、20210935、20211031、20211032、20211035、20220124、20220132、20220233,编号依次为S1~S12)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Thermo BDS C18液相色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm),柱温:30℃;以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相进行梯度洗脱(0~10.0 min,13.0%A;10.0~23.0 min,13.0% →39.0%A;23.0~41.0 min,39.0%→60.0%A;41.0~55.0 min,60.0%→64.0%A;55.0~65.0 min,64.0%→13.0%A);体积流量:1.0 mL·min-1,波长切换:0~23 min,在257 nm[7-9]检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素,23~42 min,在330 nm[10-14]检测松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷,42~65 min,在220 nm[15-17]检测白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ;进样量:10 µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

精密称取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ各适量,用70%甲醇制成质量浓度分别为0.1580,0.0920,0.0680,0.2740,1.3140,0.3620,0.7500,0.3380,0.0740,0.0560 mg·mL-1的混合贮备液。精密吸取2.5 mL混合贮备液稀释20倍得到混合对照品溶液(毛蕊异黄酮葡萄糖苷7.90 μg·mL-1、芒柄花苷4.60 μg·mL-1、毛蕊异黄酮3.40 μg·mL-1、芒柄花素13.70 μg·mL1、松果菊苷65.70 μg·mL-1、管花苷A 18.10 μg·mL-1、毛蕊花糖苷37.50 μg·mL-1、异毛蕊花糖苷16.90 μg·mL-1、白术内酯Ⅲ 3.70 μg·mL-1、白术内酯Ⅰ 2.80 μg·mL-1)。

2.2.2 供试品溶液

精密吸取芪蓉润肠口服液2.0 mL,置25 mL量瓶中,加70%甲醇20 mL,超声处理(频率:40 kHz,功率:250 W)30 min,放冷至室温,加70%甲醇至刻度,摇匀,滤过,作为芪蓉润肠口服液供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液

按芪蓉润肠口服液质量标准中的处方及制法分别制备缺炙黄芪、缺肉苁蓉地黄和玄参、缺白术的阴性样品,分别按“2.2.2”项下方法制成炙黄芪阴性样品溶液、肉苁蓉地黄玄参阴性样品溶液、白术阴性样品溶液。

2.3 系统适用性与专属性试验

依法进样“2.2”项中对照品溶液、芪蓉润肠口服液供试品溶液及3个阴性样品溶液,所得芪蓉润肠口服液色谱图(图1)中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ与相邻峰的分离度均符合要求(不小于1.5),对称因子符合规定(0.95~1.05之间),理论板数按各成分计均符合规定(≥5 500),处方中其他成分不干扰检测。

  • 图1 HPLC色谱图
    Figure 1.HPLC chromatograms
    注:1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷;2.芒柄花苷;3.毛蕊异黄酮;4.芒柄花素;5.松果菊苷;6.管花苷A;7.毛蕊花糖苷;8.异毛蕊花糖苷;9.白术内酯Ⅲ;10.白术内酯Ⅰ

2.4 线性回归试验及相对校正因子(RCF)计算

精密量取“2.2.1”项混合贮备液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0 mL,分别用70%甲醇稀释成20 mL,得到6个质量浓度的混合对照品溶液,依次进样分析,以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的峰面积(Y)对质量浓度(X,μg·mL-1)进行线性回归计算,结果见表1。以毛蕊花糖苷为内参物,按照RCF计算公式:RCFR/S=ƒR÷ƒS=(AS×CR)÷(AR×CS)(式中A代表峰面积,C代表质量浓度,下标R和S分别代表内参物和其他成分),分别计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的RCF,结果见表2,各成分RCF的RSD在0.23%~1.84%(n=6)之间。

  • 表格1 芪蓉润肠口服液中10个成分的回归方程、线性范围和相关系数
    Table 1.Regression equations,linear range and correlation coefficient of ten components in Qirong Runchang oral liquid

  • 表格2 芪蓉润肠口服液中各成分的RCFs结果(n=6)
    Table 2.The results of relative correction factors in Qirong Runchang oral liquid (n=6)

2.5 精密度、重复性和稳定性试验

依法取“2.2.1”项混合对照品溶液重复6次进样分析检测,得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ峰面积的RSD依次为1.03%,1.18%,1.29%,0.91%,0.55%,0.70%,0.67%,0.95%,1.12%和1.04%(n=6),表明仪器精密度良好。

取芪蓉润肠口服液(编号:S1),按照“2.2.2”项下方法制备芪蓉润肠口服液供试品溶液6份,依法进样分析,得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ平均含量分别为0.085,0.052,0.035,0.155,0.869,0.218,0.441,0.187,0.043,0.030 mg·mL-1,其RSD依次为1.60%,1.79%,1.81%,1.54%,0.98%,1.23%,1.15%,1.64%,1.75%和1.88%(n=6),表明本法重复性良好。

取一份芪蓉润肠口服液(编号:S1)供试品溶液于制备后0,2,5,10,18和24 h进样分析,得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ峰面积的RSD依次为1.17%,1.29%,1.35%,1.08%,0.61%,0.89%,0.74%,1.12%,1.30%和1.19%(n=6),表明芪蓉润肠口服液供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 加样回收率试验

精密吸取已知毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ含量的芪蓉润肠口服液(编号:S1)1.0 mL,共吸取9份样品,分为3组,每组分别精密加对照品溶液(含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.0850 mg·mL-1、芒柄花苷0.0510 mg·mL-1、毛蕊异黄酮0.0380 mg·mL-1、芒柄花素0.1550 mg·mL-1、松果菊苷0.8760 mg·mL-1、管花苷A 0.2190 mg·mL-1、毛蕊花糖苷0.4330 mg·mL-1、异毛蕊花糖苷0.1890 mg·mL-1、白术内酯Ⅲ 0.0420 mg·mL-1和白术内酯Ⅰ 0.031 mg·mL-1)0.8,1.0,1.2 mg,再按“2.2.2”项步骤处理得供试品溶液,依法进样分析,计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ的加样回收率及RSD分别为96.94%(1.32%),97.48%(1.61%),97.80%(1.72%),98.81%(1.50%),100.11%(0.56%),99.10%(0.91%),100.06%(0.76%),98.60%(1.18%),98.41%(1.25%)和96.92%(0.85%)(n=9)。

2.7 RCF耐用性考察

2.7.1 仪器及色谱柱

选用不同高效液相色谱仪(Agilent 1260型和UltiMate 3000型)及不同液相C18色谱柱(Thermo BDS C18、Capcell C18和Hedera C18),取“2.2.1”项混合对照品溶液进样分析检测,得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ RCF的RSD在0.52%~1.94%(n=6)之间 (表3)。

  • 表格3 不同仪器、色谱柱测得的RCFs(n=6)
    Table 3.Relative correction factors measured by different instruments and chromatographic columns of different brands (n=6)

2.7.2 流速

在设定不同流速条件下进样“2.2.1”项混合对照品溶液分析检测,得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ RCF的RSD在0.51%~1.91%(n=5)之间(表4)。

  • 表格4 不同流速下测得的RCFs(n=5)
    Table 4.Relative correction factors for different velocity measurements(n=5)

2.7.3 柱温

在设定不同柱温条件下进样“2.2.1”项混合对照品溶液分析检测,得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ RCF的RSD在0.63%~1.85%(n=5)之间(表5)。

  • 表格5 柱温不同测得的RCFs(n=5)
    Table 5.Relative correction factors measured at different column temperatures (n=5)

2.8 各成分色谱峰的定位

以毛蕊花糖苷为内参物,依法进样“2.2.1”项混合对照品溶液检测分析,考察其他9种成分在Agilent 1260型和UltiMate 3000型高效液相色谱仪及液相色谱柱Thermo BDS C18、Capcell C18和Hedera C18条件下相对保留时间的重现性(表6),相对保留时间值的RSD在0.61%~1.45%(n=6)之间。

  • 表格6 不同仪器和不同色谱柱待测成分色谱峰的相对保留值(n=6)
    Table 6.Relative retention value of the components under test on different instruments and chromatographic columns (n=6)

2.9 含量测定

取芪蓉润肠口服液12批,按“2.2.2”项芪蓉润肠口服液供试品溶液制备步骤制备供试品溶液,依法进样检测分析,分别采用ESM和QAMS法计算各成分含量,结果见表7。利用 SPSS 26.0统计学软件,采用t检验对两种方法所测得结果进行比较,结果差异无统计学意义(P>0.05)。

  • 表格7 ESM和QAMS测定芪蓉润肠口服液10个成分的质量浓度(mg·g-1,n=3)
    Table 7.Mass concentrations of ten components in Qirong Runchang oral liquid by ESM and QAMS (mg·g-1, n=3)

2.10 芪蓉润肠口服液的化学计量学质量分析

2.10.1 聚类分析

运用SPSS 26.0软件组间联接和Euclidean距离的聚类方法,对表7中QAMS法计算的含量数据进行分析(图2)。从图2可知,当类间距为10时,12批芪蓉润肠口服液供试品最终聚为3类,S3、S5、S6、S1、S4和S2第Ⅰ类,S8、S9和S7为第Ⅱ类,S10、S11和S12为第Ⅲ类。从分类结果可以看出,各成分含量差异与生产阶段有关,但同一阶段生产的含量也稍有波动,这可能与生产所用原药材采收地、采收时间相关,同时炮制过程也影响原药材质量,因此生产中要加强原药材产地管理,规范炮制方法,细化生产参数,从根本上把控产品质量。

  • 图2 12批芪蓉润肠口服液样品聚类树状图
    Figure 2.Tree Diagram of cluster analysis for 12 batches of Qirong Runchang oral liquid samples

2.10.2 主成分分析(PCA)

将表7中QAMS法测定结果导入SPSS 26.0软件,采用降维的方式对主成分进行提取,得各主成分特征值和方差贡献率(表8)及成分矩阵表(表9)。由表8可知前2个主成分特征值:6.675和2.412(大于1),对方差的贡献率分别为66.748%和24.116%,累计方差贡献率为90.864%(大于85%)。从表9可以看出第一主成分的信息来自芒柄花苷、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和白术内酯Ⅰ等成分的综合,第二主成分的信息来自毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和白术内酯Ⅲ的信息。同时应用统计软件SIMCA 14.1建立PCA模型,12批芪蓉润肠口服液样品PCA得分图(图3),共提取出2个主成分R2X为0.908(大于0.5),表明所建立的模型稳定性较高。从图3可以看出,S1~S6、S7~S9以及S10~S12分别呈现一定关联性。

  • 表格8 主成分特征值和贡献率
    Table 8.Initial eigenvalues and contribution rate of principal components

  • 表格9 芪蓉润肠口服液中10个成分成分矩阵表
    Table 9.Post-rotation factor load matrix of 10 components in Qirong Runchang oral liquid

  • 图3 12批芪蓉润肠口服液样品的PCA得分图
    Figure 3.PCA score chart for 12 batches of Qirong Runchang oral liquid samples

2.10.3 偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)

将表7中QAMS法含量数据导入SIMCA 14.1统计软件,运行PLS-DA程序,提取到2个主成分,得到PLS-DA模型,其模型解释能力参数(R2X、R2Y)分别为0.933和0.913,预测能力参数Q2为0.840,两者高于0.5,说明模型拟合度较好,具有较高的稳定性和预测率。经PLS-DA模型拟合分析分别生成得分图(图4)和变量重要性投影(VIP)图(图5)。由图4可以看出12批芪蓉润肠口服液的含量数据点均落在95%CI内。图5中变量VIP值大于1的有5个成分(松果菊苷VIP=1.432、毛蕊异黄酮葡萄糖苷VIP=1.278、白术内酯Ⅲ VIP=1.212、管花苷AVIP=1.138、毛蕊花糖苷VIP=1.020),表明松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、白术内酯Ⅲ、管花苷A和毛蕊花糖苷是影响不同批次芪蓉润肠口服液样品差异性的主要标记物。

将模型建立时分类Y矩阵变量定义为随机排列200次做置换检验,得到R2拟合直线Y轴截距为0.161,小于0.3,表明所建立的PLS-DA模型结果可靠;Q2拟合直线Y轴截距为-0.221,表明所建模型可靠,不存在过度拟合成现象。见图6。

  • 图4 12批芪蓉润肠口服液样品的PLS-DA模型得分图
    Figure 4.Score chart of PLS-DA model for 12 batches of Qirong Runchang oral liquid samples

  • 图5 12批芪蓉润肠口服液样品的VIP图
    Figure 5.VIP images of 12 batches of Qirong Runchang oral liquid samples

  • 图6 PLS-DA置换检测结果图
    Figure 6.Figures of PLS-DA replacement detection results

3 讨论

3.1 流动相的优化过程

本试验首先选用乙腈-水和甲醇-水系统进行对比考察,结果发现两种流动相均出现不同程度的基线漂移,干扰检测,且个别色谱峰拖尾,甲醇-水尤为明显,考虑采用乙腈-水体系,加入0.1%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液或0.1%乙酸溶液调节改善。结果显示乙腈-0.1%磷酸为流动相时效果最佳。通过不断摸索流动相中有机相与水相的比例,控制待测成分的出峰时间,有效降低梯度洗脱程序变化对待测成分定量检测的影响,同时逐渐调整流动相比例,控制流动相中有机相和水相的调整幅度,确保色谱图的基线稳定以及各待测成分检测结果的准确性,最终确定以“2.1”项下色谱条件进行梯度洗脱。此条件下芪蓉润肠口服液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ峰形尖锐,基线分离,10种成分与相邻色谱峰间分离度好,检测时间合理。

3.2 供试品提取方式的确定

芪蓉润肠口服液质量标准“性状”项下规定:本品为棕褐色的液体,久置可有少量沉淀。考虑到不同批次样品间沉淀量存在一定差异,同时沉淀量对各成分含量可能产生一定的影响,直接稀释法进行供试品溶液制备影响检测结果的准确性,为确保所建立方法的通用性,避免沉淀对含量检测结果的影响,分别考察了提取方式(超声提取[8,10-17]、加热回流提取[7])、提取溶剂(100%甲醇[7-8,15-17]、70%甲醇[11]、50%甲醇[10,12,14]、水[9])、提取时间(20,30,40,60 min)及提取次数对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ含量的影响,最终确定采用70%甲醇超声处理30 min对供试品进行制备。

3.3 检测波长的选择

中成药复方制剂所含成分繁多,单一波长难以确保各待测物质在最佳检测波长下检测,为提高检测灵敏度,本试验采用波长切换技术对芪蓉润肠口服液中多组分含量进行同时检测。同时波长切换时间应结合各待测成分的保留时间来确定,严格掌握切换时间是高效液相色谱波长切换技术的关键,直接影响色谱峰基线的平稳性和检测结果的准确性。本课题组在试验过程中,通过对各待测成分全波长紫外扫描,同时对波长切换时间进行不断摸索和优化,最终确定在0~23 min采用257 nm对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素进行检测,在23~42 min采用330 nm对松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷进行检测,在42~65 min采用220 nm对白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅰ进行检测,在此条件下,各待测成分灵敏度高,检测结果准确,各成分与相邻色谱峰均能达到完全分离。

3.4 小结

本试验采用HPLC-QAMS法同时检测芪蓉润肠口服液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ含量,通过精密度试验、重复性试验、稳定性试验及准确度试验考察均符合方法学要求,一测多评法与外标法结果无明显差异,且降低了检验成本,检验用时合理,同时结合化学计量学,运用聚类分析、PCA和PLS-DA模式识别找出5个差异标志物,对提升控制芪蓉润肠口服液样品整体质量控制和标准提供了数据参考。

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