目的  测定大七厘制剂中砷甜菜碱（AsB）、砷胆碱（AsC）、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、亚砷酸根（As Ⅲ）、砷酸根（AsV）6种砷形态的含量，并进行安全性评价。

方法  样品用人工肠液置37℃水浴中超声提取，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法检测，色谱条件：Hamilton PRP-X100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 μm），以100 mmol·L^-1碳酸铵溶液（含2%甲醇）-2%甲醇为流动相进行梯度洗脱，流速：0.8 mL·min^-1。

结果  方法检测限范围为2.00~6.00 μg·kg^-1，在1~200 ng·mL^-1范围内，r均≥0.999 8，加样回收率范围为96.15%~101.76%，RSD小于2%（n=6）。大七厘制剂中砷元素主要以毒性较大的无机砷形式存在，其中AsⅤ含量最高，其次是As Ⅲ，AsB、AsC、MMA和DMA均未检出，其潜在的健康安全风险较大。

结论  所建立的方法准确、重复性好，可为评价大七厘制剂的安全性提供参考。建议将无机砷（As Ⅲ、AsⅤ）作为大七厘制剂的毒性限量指标。

大七厘制剂包括大七厘散、大七厘片、大七厘胶囊和大七厘丸4种剂型，由自然铜、硼砂、血竭、土鳖虫、大黄、骨碎补、当归尾、乳香、三七、没药、冰片共11味药材全部以生药粉投料制成，具有化瘀消肿、止痛止血的功效，用于治疗跌打损伤、瘀血疼痛、外伤止血，临床应用广泛[1]。由于含有矿物药自然铜和硼砂，大七厘制剂中有害元素含量时有超标。课题组前期研究[2]采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定大七厘制剂中5种可溶性重金属含量，结果显示砷为大七厘制剂中最易超标的有害元素。砷有致癌性，进入人体后会引起神经系统等疾病。已证实砷的毒性与其存在形态密切相关，分为无机砷和有机砷。无机砷包括被确定为一级致癌物的亚砷酸盐（As Ⅲ）、砷酸盐（As Ⅴ），毒性很强；有机砷如二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）是潜在致癌物，毒性较弱，砷甜菜碱（AsB）、砷胆碱（AsC）等基本认为无毒[3]。因此检测大七厘制剂中的砷形态含量更能反映其安全性，但相关研究尚未见报道。

砷形态的检测方法主要有离子色谱-电感耦合等离子体质谱法（IC-ICP-MS）[4-5]、高效液相色谱-原子荧光光谱法（HPLC-HG-AFS）[6-7]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）[8-11]。其中HPLC-ICP-MS法具有宽线性范围、低检出限和高灵敏度等优点，能检测较多的砷形态[12]，在砷形态分析中已得到广泛的应用。本研究参考中国药典2020年版四部通则砷元素形态及其价态测定法[13]，首次采用HPLC-ICP-MS法测定大七厘制剂中砷形态含量，并进行安全性评价，为含矿物中成药中砷形态研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent 7700型电感耦合等离子体质谱仪（美国安捷伦公司）；Mill-Q Directl6型纯水器（美国默克密里博公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ML204型电子天平（上海梅特勒托利多有限公司，精度为0.1 mg） ；LXJ-IIB型低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 标准物质

As Ⅲ [批号：21071，以砷计（75.7±1.2）μg·g^-1]、As Ⅴ [批号：2104，以砷计（17.5±0.4） μg·g^-1]、AsB[批号：21101，以砷计（38.8±1.1）μg·g^-1]、AsC [批号：21071，以砷计（28.0±1.1）μg·g^-1]、MMA [批号：21101，以砷计（25.1±0.8） μg·g^-1]、DMA [批号：21071，以砷计（52.9±1.8）μg·g^-1]标准溶液，以及砷单元素标准溶液（GBW 08611-8113，1 000 μg·mL^-1），均购自中国计量科学研究院。

1.3 试药

胰酶为生化试剂（批号：20150429，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇为色谱纯（Sigma公司）；硝酸、30%过氧化氢为优质纯（Sigma公司）；其他试剂均为分析纯，水为去离子水。

26批样品共来自4家企业，其中大七厘丸（规格：0.2 g/丸）11批，来自江西仁丰药业有限公司；大七厘散（规格：1.5 g/袋）3批，来自厦门中药厂有限公司；大七厘胶囊（规格：0.3 g/粒）8批，来自江西昂泰制药有限公司；大七厘片（规格：0.35 g/片）3批，来自江西桔王药业有限公司。为考察自然铜的影响，由江西桔王药业有限公司制备1批不含自然铜的大七厘片样品（即未加自然铜外，取其他药材按制法制成样品）。

2 方法与结果

2.1 仪器工作参数

2.1.1 质谱条件

等离子体功率：1 600 W；载气：高纯氩气；载气流速：0.79 L·min^-1；采样深度：7.6 mm；蠕动泵转速：0.5 r·s-1；辅助气流速：0.35 L·min^-1；氦气流速：4.5 mL·min^-1；检测质量数m/z 75（As）；积分时间：1.0 s；分析模式：He碰撞模式。

2.1.2 液相色谱条件

采用Hamilton PRP-X100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；以100 mmol·L^-1碳酸铵与2%甲醇混合溶液（氨水调节pH至9.0）为流动相A，以2%甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：0.8 mL·min^-1；柱温：25℃；进样量：20 μL。通过单标分析确认6种形态砷的出峰顺序为AsC、AsB、As Ⅲ、DMA、MMA、As Ⅴ，标准溶液和供试品溶液的典型色谱图见图1。

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  表格1 梯度洗脱程序

  Table 1.Gradient elution procedure

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  图1 空白样品溶液（A）、混合标准溶液（B）和大七厘丸供试品溶液（C）的HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC of blank sample (A), mixed reference substances (B) and Daqili pill sample (C)

  注：1. AsC，2. AsB，3. As Ⅲ，4. DMA，5. MMA，6. As Ⅴ

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2.2 砷形态标准溶液的配制

As Ⅲ、As Ⅴ、MMA、DMA、AsB、AsC标准溶液浓度分别为（75.7±1.2）μg·g^-1，（17.5±0.4）μg·g^-1，（25.1±0.8）μg·g^-1，（52.9±1.8）μg·g^-1，（38.8±1.1）μg·g^-1，（28.0±1.1）μg·g^-1，用重量法分别对应称取0.132 1，0.571 4，0.398 4，0.189 1，0.257 7，0.357 1 g ，加水至5 mL，配制成2 μg·mL^-1（均以砷计）的各种砷形态储备液。再分别吸取6种砷形态储备液适量，加0.02 mol·mL^-1乙二胺四醋酸二钠溶液配制成1，5，20，40，80，200 ng·mL^-1的6种砷形态混合标准溶液。

2.3 供试品溶液与空白样品溶液的制备

取本品适量，研细（过四号筛），取约1.0 g，精密称定，精密加入人工肠液[按中国药典2020年版四部通则8004磷酸盐缓冲液（含胰酶）（pH 6.8）[13]制备] 25 mL，置37℃水浴中超声处理（功率：500 W, 频率：40 kHz）2 h，摇匀，离心（1 200×g）5 min，精密吸取上清液1 mL，用0.02 mol·L^-1乙二胺四醋酸二钠溶液稀释至5 mL，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。取相同体积的人工肠液，同法制备空白样品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察、检测限

取“2.2”项下系列浓度的混合标准溶液，按“2.1”项下分析条件分别进行测定，以溶液浓度为横坐标（X，ng·mL^-1），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，回归方程、相关系数及线性范围见表2，表明6种形态砷在各自浓度范围内线性关系良好。以3倍色谱峰信噪比计算得到6种形态砷的仪器检出限，在试样取样量为1.0 g，定容体积为125 mL时，方法检出限按仪器检出限乘稀释倍数计算，结果见表2。

• 
  表格2 线性关系试验结果

  Table 2.Linear relationship test results

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2.4.2 精密度试验

精密吸取混合标准溶液（40 ng·mL^-1）20 μL，连续进样6次，测得AsC、AsB、As Ⅲ、DMA、MMA、As Ⅴ 峰面积的RSD分别为 1.2%，1.8%，1.4%，0.9%，1.7%，1.6%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验

由于未检测到同时存在较高浓度的6种砷形态化合物的样品，因此分别向同一批样品（批号：01-191002）中加入混合对照品溶液（40 ng·mL^-1），制成6份模拟样品进行试验，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，分别进样20 μL，测得AsC、AsB、As Ⅲ、DMA、MMA和As Ⅴ的平均含量分别为39.823 0，40.058 1，40.704 9，40.107 2，40.102 3，87.186 4 ng·mL^-1，RSD分别为1.0%，1.2%，0.8%，1.4%，1.0%，0.9%（n=6），表明方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验

精密吸取混合标准溶液（40 ng·mL^-1），分别在0，2，4，6，8 h各进样1次，测得AsC、AsB、As Ⅲ、DMA、MMA和As Ⅴ 浓度的RSD分别为0.8%，0.9%，1.4%，1.0%，0.8%，1.1%（n=5），结果表明6种砷形态化合物在8 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验

采用加样回收试验，取已知含量的样品粉末（批号：01-191002，As Ⅴ含量为2.371 8 μg·g^-1，As Ⅲ含量为0.033 9 μg·g^-1，其余4种砷形态均未检出）6份，每份约1.0 g，分别精密加入混合标准溶液（2.00 μg·mL^-1）1 mL和人工肠液24 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μL测定，计算回收率。结果回收率范围在96.15%~101.76%之间，RSD小于2%（n=6）。表明方法准确性符合微量元素分析要求。

2.4.6 样品的测定

收集26批大七厘制剂样品，采用HPLC-ICP-MS法测定6种形态砷含量，同时按文献[14]的方法测定总砷含量，结果见表3。

• 
  表格3 样品中6种形态砷和总砷测定结果（μg·g-1，n=2）

  Table 3.Results of the determination of six arsenic forms and total arsenic in samples (μg·g-1, n=2)

  注：“—”表示未检出；*表示采用微波消解处理样品；#该批样品不含自然铜

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3 讨论

3.1 提取条件的考察

本研究建立了HPLC-ICP-MS法测定大七厘制剂中在模拟人体环境下可溶解于人工肠液中的不同砷形态含量。参照中国药典2020年版四部通则砷形态测定法的提取条件，模拟体内的吸收过程，采用人工肠液、较为激烈的提取方法，来保证所提取的砷形态含量是在模拟人体环境下的极限值，从而达到人体能吸收的砷元素安全控制最大化。由于中国药典方法未明确取样量、溶剂用量和超声时间，因此考察了取样量（0.25，0.5，1.0 g）、溶剂用量（10，25，50 mL）和超声时间（1，2，3，4 h）等因素对大七厘制剂中砷形态含量的影响，结果表明：1.0 g样品中加人工肠液25 mL，置37℃水浴中超声处理2 h，砷形态含量可达最高。为降低溶剂效应，避免出现双峰和拖尾，供试品溶液最后需用乙二胺四醋酸二钠溶液进行稀释定容，分离效果更好，峰形更尖锐[15]。研究[2]表明，样品的粒径对测定结果有影响，研细过四号筛的粉末测定效果最好。

3.2 色谱条件考察

砷元素多以阴离子形态存在，因此选择Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱进行分离，并对流动相系统和流速进行了优化。中国药典2020年版四部通则砷元素形态及其价态测定法采用25 mmol·L^-1磷酸二氢铵溶液（氨水调节pH至8.0）作为流动相，流速为1.0 mL·min^-1。本研究采用100 mmol·L^-1碳酸铵与2%甲醇混合溶液（氨水调节pH至9.0）作为流动相，是因为磷酸二氢铵具有难挥发性，易污染质谱的采样锥而导致质谱熄火，而碳酸铵流动相进入质谱后，可以在高温下分解挥发，不会长久沉积在采样锥表面，可减少质谱熄火等情况的发生[15]。碳酸盐浓度和pH会影响目标砷形态的分离，当碳酸铵浓度为100 mmol·L^-1时，用氨水或醋酸调节其pH至8.8~9.2，6种形态砷能完全分离且峰形较好，应注意避免来回调节pH，以免影响流动相的离子强度。研究[16]表明，在流动相中加入2%甲醇，可改善AsC、AsB峰形，提高检测灵敏度。流动相采用等度洗脱时，AsC、AsB、As Ⅲ无法实现基线分离，而采用梯度洗脱方式，通过低浓度离子强度避免AsC的惯性拖尾对AsB、As Ⅲ的影响，从而改善分离度，通过高浓度离子强度使MMA和As Ⅴ快速出峰，从而节省分析时间。经试验摸索，当流速为0.8 mL·min^-1时，6种形态砷能完全分离且峰形较好。因此，最终选择以100 mmol·L^-1碳酸铵与2%甲醇混合溶液（氨水调节pH至9.0）为流动相A，以2%甲醇为流动相B，流速为0.8 mL·min^-1，采用梯度洗脱方式成功实现了6种形态砷的良好分离。

3.3 测定结果的分析

从样品检测结果来看，大七厘制剂中总砷含量高，但经人体肠液消化后大部分砷元素被排出体外，被吸收的砷含量约占总砷含量的10.07%~25.88%，其中As Ⅴ含量最高，其次是 As Ⅲ，AsB、AsC、MMA和DMA均未检出，说明大七厘制剂中砷元素是以毒性较大的无机砷形式存在，其潜在的健康安全风险较大。中国药典2020年版仅对雄黄进行了As Ⅲ和As Ⅴ的限量测定，对中成药暂无相关检测要求，大七厘制剂执行标准中尚无砷形态检测项，其安全性评价没有参考值。因此建议将无机砷（As Ⅲ、As Ⅴ）作为大七厘制剂的毒性限量指标，参照联合国粮农组织/世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会[FAO/WHO（JECFA）] [17]推荐总砷每日允许摄入量为128 μg，根据大七厘制剂的用法用量换算成每日最大服用量，计算得到大七厘胶囊、散、丸、片的推荐限量分别为28.00，28.00，21.00，24.00 μg·g^-1，按此标准判定，3批大七厘片中各种砷形态含量超过限量，其他样品均未超过限量。

大七厘不同剂型的制法相同之处是处方药材全部以生药粉投料制成，不同之处是根据成型工艺特点加入的辅料不同，其中大七厘胶囊、大七厘散未加入任何辅料，大七厘丸加入微晶纤维素、羧甲淀粉钠，大七厘片加入单糖浆。不同剂型和同剂型不同批次样品中无机砷含量存在差异，大七厘胶囊在2.40~4.60 μg·g^-1之间，大七厘散在6.63~13.08 μg·g^-1之间，大七厘丸在2.36~18.68 μg·g^-1之间，大七厘片在39.35~47.61 μg·g^-1之间，而未加自然铜的大七厘片中总砷和无机砷含量均很低，提示样品中无机砷含量的高低可能与投入生产的自然铜原料密切相关。由于自然铜在入药前需经煅制，煅制后砷等重金属含量会显著降低[18]，如企业使用未煅制或煅制不充分的自然铜投料，则可能造成大七厘制剂样品中无机砷含量偏高。因此，控制好自然铜、硼砂原料的砷含量，可有效降低大七厘制剂中无机砷污染水平。

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