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目的 制备枸橼酸西地那非纳米结构脂质载体（SC-NLCs），考察其理化性质，并评价其体外释放行为。
方法 采用薄膜超声分散法制备SC-NLCs，并对制得的SC-NLCs进行理化性质考察；建立HPLC法测定SC-NLCs体外释放中枸橼酸西地那非的含量，利用动态膜透析法对SC-NLCs与枸橼酸西地那非溶液的体外释放性能进行考察。
结果 SC-NLCs在水中分散为乳白色且可见乳光的胶体溶液，具有良好的分散特征，透射电镜观察显示SC-NLCs外观较为圆整，分布均匀。平均粒径、包封率、电位、多分散系数分别为66.96 nm、（69.26±0.73）%、（18.00±4.84）mV和0.247。体外释放试验结果显示，枸橼酸西地那非溶液在pH 5.5的磷酸缓冲盐溶液中4 h后累积释放的枸橼酸西地那非达（97.32±3.14）%，而SC-NLCs在4 h累积释放的枸橼酸西地那非约（72.16±2.51）%，在24 h后达到释放平台，累积释放的枸橼酸西地那非约（84.29±2.00）%。
结论 制备的SC-NLCs粒径大小均一，分散均匀；在体外释放行为方面，亦具有良好的缓释特性。
枸橼酸西地那非（sildenafil citrate，SC）是被批准用于治疗肺动脉高压的首个磷酸二酯酶-5抑制剂，可特异性地活化一氧化氮/环磷酸鸟苷通路而发挥舒张血管作用，即SC主要是通过抑制磷酸二酯酶-5对一氧化氮/环磷酸鸟苷的降解，提高局部一氧化氮/环磷酸鸟苷的浓度，使得肺血管平滑肌舒张[1]。磷酸二酯酶-5主要分布在肺部，因而磷酸二酯酶-5抑制剂选择性扩张肺血管，显著降低平均肺动脉压与肺血管阻力，可有效治疗肺动脉高压[2]。然而，SC的体内半衰期短（约3~4 h），需要重复给药以维持血浆药物浓度，对疾病的长期治疗造成不便，且口服和静脉注射均可能导致一些严重的不良反应，如静息性低血压、鼻出血、视力突然丧失和阴茎勃起时间延长等[3-5]。研究者正在寻找新型长效载体，以期能够延长SC在体内的滞留与作用时间[6]。
纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLCs）是用表面活性剂稳定的脂核将药物包裹或使药物附着而构成的纳米递药系统[7]。NLCs的组成包括固、液脂质与表面活性剂，其中固、液脂质的存在使颗粒的结构为结晶缺陷型或无定形，此种结构有以下优点：载药增加、提高包封率、避免药物泄露、控制固液脂质比可增加缓控释效果[8-9]。NLCs的组成生物相容、可生物降解和无毒无刺激，并且大多数具有美国食品药品管理局评价食品添加剂的安全性指标GRAS认证[9]。所以本研究拟制备SC-NLCs，以期提供持续的药物释放，提高体内的生物利用度，减少不良反应。本课题组建立了NLCs制剂中SC含量的HPLC测定法，考察药物的体外释放行为，为SC的新剂型研究提供理论依据。
1 仪器与试药
1260 Infinity液相色谱仪（美国Agilent公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；5430R型低温超速离心机（德国Eppendorf公司）；KQ5200E型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；Infinite 200 PRO型多功能酶标仪（Tecan集团奥地利有限公司）；NanoZS90型光散射粒径分析仪（英国Malven公司）；HZQ-C型空气浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）。
枸橼酸西地那非（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C12190359，纯度＞99%）；大豆磷脂（上海艾伟拓医药科技有限公司，批号：SY-SO-200801）；单硬脂酸甘油酯（上海艾研生物科技有限公司，批号：20180817）；油酸（天津市致远化学试剂有限公司，批号：2019-042080）；吐温80（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20201008）；乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 SC-NLCs的制备
采用薄膜水化法制备SC-NLCs。称取50.0 mg SC、20.68 mg单硬脂酸甘油酯、10.34 mg油酸和310.2 mg大豆磷脂，置于盛有10 mL甲醇的EP管中加热超声处理（功率调至25%，超声时间2 s，间隔时间5 s），使其成为均匀溶液；转移至茄形瓶中，于适宜温度下旋转蒸发至其形成均匀薄膜层；加入同温度下10 mL 1.25%吐温80溶液，水化20 min使薄膜层与水相充分混合；水化后的混合液体在冰水浴下采用超声细胞破碎仪超声分散1 min，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得SC-NLCs混悬液，4℃条件下储存备用。
2.2 SC-NLCs包封率和载药量的测定
采用超滤离心法分离SC-NLCs中游离的SC。选择截留相对分子质量为100 kDa的超滤离心管，吸取400 μL SC-NLCs加入超滤离心管的内管中，并组装内外管。采用高速冷冻离心机在4℃、24 104×g条件下离心40 min进行游离药物的分离；离心后取100 μL滤液稀释后采用HPLC法测定游离药物含量；另取等量SC-NLCs溶液，加等体积甲醇稀释后进行HPLC测定，得到药物总量。计算包封率和载药量：
包封率（%）= W药物 / W总×100%
载药量（%）= W药物 / W纳米粒×100%
式中，W药物为包封药物量，W总为总的药物量，W纳米粒为载药NLCs的总质量。结果计算得SC-NLCs包封率为（69.26 ± 0.73）%，载药量为（6.11 ± 0.13）%。
2.3 SC-NLCs的形态观察
将1滴新鲜制备的SC-NLCs溶液滴到覆有支撑膜的铜网上，固定2~3 min后，铜网边缘多余的液体用滤纸吸干，用1%的磷钨酸液染色2~3 min后吸干多余染液，自然干燥。透射电镜下观察制剂的外观形态为类圆状颗粒，粒径小，分散性良好，且无聚集与粘连现象（图1）。
2.4 粒径与Zeta电位
采用Marlven Nano ZS90分析仪测定SC-NLCs的Zeta电位，将样品用一次性注射器的针筒转移至样品池中，直至样品充满样品池。观察样品池中是否无气泡，若无气泡，将样品池插入插槽中，并关上仪器盖子后，即可进行测试。结果得到SC-NLCs粒径均值为66.96 nm，粒径分布见图2-A；Zeta 电位为（18.00±4.84）mV，见图2-B，多分散系数为0.247。
2.5 SC-NLCs的体外释放性质考察
2.5.1 色谱条件
采用Diamonsil® C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为30 mmol·L-1磷酸二氢钾[pH (5.2 ± 0.1)]-乙腈（62 ∶ 38）；检测波长为291 nm；进样量为10 µL；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25℃。
2.5.2 溶液的配制
对照品溶液：取约10 mg SC，精密称定，用pH 5.5磷酸盐缓冲液（释放介质）溶解后定容至50 mL，过滤后即得SC标准母液，浓度为200 μg·mL-1，将其存储于4℃条件下备用。
供试品溶液：吸取SC-NLCs 10 μL，加pH 5.5的磷酸缓冲盐溶液（PBS）超声破乳2~3 min，继续加入pH 5.5的PBS溶液稀释至2.5 mL，混匀并过滤，即得体外释放的供试品溶液，将其存储于4℃条件下备用。
空白溶液：取配制的pH 5.5的PBS，过滤即得。
2.5.3 专属性试验
取“2.5.2”项下3种溶液，稀释至所需浓度并过滤后进样，考察制剂的辅料和介质是否对组分的测定存在干扰。由图3可知，空白溶液不干扰SC的含量测定，且药物峰型尖锐，表明体外释放研究中HPLC方法测定SC含量的专属性良好。
2.5.4 线性关系考察
取“2.5.2”项下的对照品溶液，用释放介质稀释成2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0 μg·mL-1系列溶液，按“2.5.1”项下色谱条件依序进样并记录峰面积，以浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，线性方程为：A=11.458C-8.9093，r=0.9999，结果表明SC在2.0~80.0 μg·mL-1的浓度范围内，与对应的峰面积呈良好的线性关系。
2.5.5 精密度试验
分别配制浓度为低（5.0 μg·mL-1）、中（20.0 μg·mL-1）和高（60.0 μg·mL-1）的SC标准液，HPLC分析。一天内连续5次进样，计算日内精密度；连续进样5 d ，计算日间精密度。结果表明低、中、高药物浓度的SC对照品溶液的日内精密度的RSD分别为1.06%，0.96%，0.30%（n=5），日间精密度的RSD分别为1.43%，0.84%，0.37%（n=5），结果表明该方法的精密度良好。
2.5.6 回收率试验
分别吸取适量不同浓度的对照品溶液加入释放液（pH 5.5的PBS）中，制备浓度为低（17.50 μg·mL-1）、中（28.00 μg·mL-1）和高（35.00 μg·mL-1）的SC溶液，过滤后采用HPLC分析，计算回收率。结果表明低、中、高药物浓度的SC回收率分别为99.56%，100.68%和98.47%，均在98%~102%之间；且低、中、高药物浓度回收率的RSD分别为1.10%，0.16%和0.44%（n=3），均小于2%，表明用于测定SC含量的HPLC法的准确性良好。
2.5.7 稳定性试验
将配制的供试品溶液分别放置0，2，4，6，8，10，24 h后取样，记录峰面积，结果得到SC峰面积的RSD为0.53%（n=7），表明SC供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。
2.5.8 SC-NLCs的体外释放研究方法
釆用动态膜透析法进行SC-NLCs体外释放试验，精密量取l mL的SC-NLCs溶液移入已预处理好的透析袋（截留相对分子质量：8 000~14 000 D）中，将透析袋两端用透析夹夹紧，置于装有200 mL释放介质的烧杯中，将容器口密闭，并置于恒温空气浴振荡器中（恒温37℃、恒速100 r·min-1），于0.5，1，2，4，6，8，10，24，36，48 h分别从释放介质中取透析介质1 mL，并及时补充相同体积的释放介质；取出的释放介质过0.45 μm滤膜后利用HPLC测定，计算不同取样时间点的药物累积释放量（Qn）及累积释放百分数（Q%）：
式中，Cn为在t时刻SC的测定浓度，Ci为t时刻之前测定的SC浓度，V0为接受池中加入的溶液体积，V为取样体积，Q0为起始时给药池中药物总量。
SC-NLCs体外释放的药物累积释放曲线如图4所示，SC溶液在pH 5.5的PBS中释放4 h后达到释放平台，而SC-NLCs则缓慢释放药物，4 h累积释放约（72.16±2.51）%，而于2 h有突释现象，累积释放SC约（56.11±3.68）%，可能是由于部分药物吸附在载体表面所致；在24 h后达到释放平台，累积释放药物约（84.29±2.00）%，表明将SC包载于NLCs中可起到缓慢释放SC的作用。
3 讨论
目前文献[10]报道的关于研究NLCs的体外释放的方法有透析法、离心法、Franz扩散池法、流通池法和基于脂解模型的体外释放研究方法等。透析法包括正向和反向两种，正向利于交换透析膜内外的释放介质，可避免纳米粒损失和介质pH的改变等，且简单易操作，透析膜的存在能较好地将游离药物及纳米粒分离；而反向动态透析法复杂的操作易造成试验误差。离心法中释放介质可与药物充分接触，不受透析膜的影响，较适用于测定少量的纳米给药系统中的药物释放度。但对于密度较低的粒子而言，即使增加一定程度的转速也不能沉积所有粒子，从而影响下一个时间点的药物释放度测定的准确性，导致累积释放度也不准确，并且离心力还可能会造成一些纳米粒原有结构的破坏，导致纳米粒中药物的释放受到影响。Franz扩散池法具有成本低、操作简便的特点，而且取样过程中避免了损失脂质纳米粒，但由于其搅拌的控制及温度控制效果较难，导致药物浓度分布不均。流通池法能较好地模拟体内环境，满足释放漏槽条件，能自动调节药物的释放介质，可测定药物的动态释放过程。但其装置操作繁琐复杂，从而限制其在实验室条件下的应用[11]。体外脂解模型能模拟生理环境，但需恒pH滴定仪控制pH来辅助，故而试验成本较高，且试验条件还未标准化。因此本试验采用正向动态透析法考察SC-NLCs的体外释放。
本研究使用动态透析法来测量SC-NLCs中游离SC的体外药物释放行为。由于SC在水溶液中的溶解度极低，且由于SC-NLCs在pH 7.4的PBS与模拟肺液中在12 h内易出现絮凝状物质，影响体外释放的考察，因此选择PBS（pH 5.5）作为接收介质以满足漏槽条件。图4显示了SC在预定时间间隔SC-NLCs和SC溶液的释放曲线。SC-NLCs具有缓慢释放药物的特性，而SC-NLCs的药物释放机制可能涉及药物扩散，聚合物基质溶胀以及聚合物侵蚀或降解，预测SC-NLCs符合富集药物壳的核-壳模型。
本研究通过薄膜水化法成功制备SC-NLCs，电镜下形态为类圆形且分散均一，包封率与载药量较高、稳定性良好，且具有一定的缓释作用。
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