目的  建立一测多评（QAMS）法同时测定蔓荆子配方颗粒中5种成分的含量。

方法  采用UPLC法，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液，梯度洗脱；流速为0.3 mL·min^-1；柱温为30℃；检测波长为258 nm；进样量为1 μL。以蔓荆子黄素为内参物，建立其与原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸和异荭草素的相对校正因子，并在不同色谱仪和色谱柱上考察各成分相对校正因子的稳定性和耐用性。

结果  原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素、蔓荆子黄素浓度分别在0.4221~42.2064 μg·mL^-1，0.7958~79.5760 μg·mL^-1，0.5038~50.3840 μg·mL^-1，0.5464~54.6370 μg·mL^-1，0.5918~59.1766 μg·mL^-1范围内线性关系良好；平均加样回收率分别为101.41%，96.65%，101.12%，97.90%，99.64%，RSD均小于3.0%（n=9）；相对校正因子分别为1.42，1.75，1.15，0.64。QAMS计算10批蔓荆子配方颗粒5种成分的含量与外标法（ESM）测定值间均无明显差异。

结论  建立的QAMS法简单可行、结果准确，可为提升蔓荆子配方颗粒质量控制方法提供参考。

蔓荆子又名蔓荆实、荆子、万荆子、蔓青子[1]，主要分布于福建、台湾、广东等地，为马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham.或蔓荆Vitex trifolia L.的干燥成熟果实，味辛、苦，性微温，归膀胱、肝、胃经，具有疏散风热、清利头目的功效，用于风热感冒头痛、齿龈肿痛、目赤多泪、目暗不明、头晕目眩等病症[2]。蔓荆子中主要含有酚类、木脂素类、黄酮类、萜类等化学成分。现代研究[3]表明，蔓荆子具有镇痛、抗炎、降压、祛痰、抗肿瘤、抗衰老和改善微循环等药理作用。

蔓荆子配方颗粒是由蔓荆子饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，具有药性强、药效好、免煎煮、服用方便等优势，临床应用广泛。瞿昊宇等[4]、徐虎军[5]分别对蔓荆子炒制前后指纹图谱变化及不同产地蔓荆子药材质量进行了研究，张永苗等[3]通过对蔓荆子配方颗粒中原儿茶酸、对羟基苯甲酸和蔓荆子黄素的含量测定与指纹图谱的研究，分析蔓荆子配方颗粒的质量。

传统的多指标含量测定方法需要用到多种对照品，检测成本较高，耗资较大，且检测结果易受到对照品稳定性的影响。一测多评（QAMS）法是通过待测样中各成分间的内在函数关系，选择一个质量稳定且易制备的成分作为内参物，从而实现多个待测成分的同步测定[6]。QAMS法现在已广泛应用于中药材及其相关制剂的质量控制中，近年来在复方研究领域也开始崭露头角。为全面控制蔓荆子配方颗粒质量，本研究利用QAMS法，以蔓荆子黄素为内参物，同时测定蔓荆子配方颗粒中原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素、蔓荆子黄素5种化学成分的含量，以期为提升蔓荆子配方颗粒质控方法提供数据支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters H-Class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Thermo Vanquish型超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher仪器公司）；XP26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；JJ2000B型百分之一天平（常熟市双杰测试仪器厂）；Milli-Q Direct型超纯水系统（德国Merck公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

原儿茶酸（批号：110809-201906，纯度97.70%）、异荭草苷（批号：111974-201401，纯度94.0%）、蔓荆子黄素（批号：111554-201705，纯度98.30%）对照品均购自中国食品药品检定研究院，对羟基苯甲酸（批号：wkq21022204，纯度99.89%）对照品购自四川维克奇生物科技有限公司，香草酸（批号：20041703，纯度99.34%）对照品购自成都普菲德生物科技有限公司；甲醇为色谱纯（德国Merck公司），磷酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。本研究所用10批蔓荆子配方颗粒（编号：S1~S10）由广东一方制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸（B）梯度洗脱（0~2 min，5%→30%A；2~7 min，30%→34%A；7~15 min，34%→80%A；15~16 min，80%→5%A；16~20 min，5%A）；流速：0.3 mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：258 nm；进样量：1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素、蔓荆子黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含42.2064，79.5760，50.3840，54.6370，59.1766 μg的混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取蔓荆子配方颗粒，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。另取辅料约0.2 g，同上述方法制备辅料溶液作为阴性样品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、阴性样品溶液及供试品溶液，按“2.1”项下方法进样测定。结果如图1所示，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应的保留时间处具有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。

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  图1 专属性试验UPLC色谱图

  Figure 1.The UPLC chromatogram of specific test

  注：1.原儿茶酸；2.对羟基苯甲酸；3.香草酸；4.异荭草素；5.蔓荆子黄素

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2.4.2 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下混合对照品储备液，加甲醇制成系列质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样测定，记录色谱图。以对照品质量浓度（X，μg·mL^-1）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得到各待测组分的回归方程及线性范围见表1。可知5个成分在相应质量浓度范围内呈良好的线性关系。

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  表格1 线性关系考察结果

  Table 1.Linear relationship investigation results

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2.4.3 精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素、蔓荆子黄素色谱峰峰面积的RSD分别为0.21%，0.14%，0.09%，0.17%，0.15%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验

取蔓荆子配方颗粒（编号：S5），研细，精密称定，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素、蔓荆子黄素平均含量分别为0.2153%，0.2620%，0.1704%，0.0996%，0.1486%，其RSD分别为2.44%，2.47%，2.04%，1.79%，2.93%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

取蔓荆子配方颗粒（编号：S5），研细，精密称定，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0，2，4，8，12 h进样测定，计算原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素、蔓荆子黄素色谱峰峰面积的RSD分别为0.49%，0.34%，0.80%，0.20%，2.45%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验

取已知含量的蔓荆子配方颗粒（编号：S5），研细，精密称取9份，每份约0.1 g，分为3组，每组分别按高、中、低浓度精密加入混合对照品溶液。按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰峰面积，计算加样回收率及RSD。结果显示，原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素、蔓荆子黄素的平均加样回收率分别为101.40%，96.65%，101.12%，97.90%，99.64%，RSD分别为1.48%，2.24%，2.46%，2.59%，2.33%（n=9），表明该方法准确性良好。

2.5 相对校正因子的确定

取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以蔓荆子黄素为内参物，考察不同进样量（0.2，0.5，0.8，1.0，1.5，2.0 μL）下原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素的相对校正因子。公式为f_s/i=f_i/f_s=(C_i/A_i)/(C_s/A_s)=(C_i×A_s)/(C_s×A_i)，式中A_s为内参物S峰面积，C_s为内参物S浓度，A_i为某待测成分i峰面积，C_i为某待测成分i浓度[8-9]。计算得相对校正因子分别为1.42，1.75，1.15，0.64，且各成分相对校正因子的RSD均小于3%（n=6），结果见表2。

• 
  表格2 各成分相对校正因子（n=6）

  Table 2.Relative correction factor of each component (n=6)

  

2.6 耐用性和系统适应性考察

2.6.1 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

分别考察Waters H-Class型、Thermo Vanquish型2种超高效液相色谱仪及Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Shimadzu Shim-pack Scepter C₁₈-120（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）、YMC Triart C₁₈ Column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）3种色谱柱对相对校正因子的影响[10]，结果见表3。各成分相对校正因子的RSD均小于3.0%（n=6），表明不同仪器和色谱柱对各成分的相对校正因子无明显影响。

• 
  表格3 不同色谱系统和色谱柱对相对校正因子的影响（n=6）

  Table 3.Effect of different chromatographic systems, and columns on the relative correction factors (n=6)

  

2.6.2 不同柱温对相对校正因子的影响

以蔓荆子黄素为内参物，考察不同柱温（25，30，35，40 ℃）下的相对校正因子[11]，结果见表4。各成分相对校正因子的RSD均小于3.0%（n=4），表明不同柱温对各成分相对校正因子无明显影响。

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  表格4 不同柱温对相对校正因子的影响（n=4）

  Table 4.Effect of different column temperature on the relative correction factors (n=4)

  

2.6.3 不同流速对相对校正因子的影响

以蔓荆子黄素为内参物，考察不同流速（0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 mL·min^-1）下的相对校正因子[11]，结果见表5。各成分相对校正因子的RSD均小于3.0%（n=5），表明不同柱温对各成分相对校正因子无明显影响。

• 
  表格5 不同流速对相对校正因子的影响（n=5）

  Table 5.Effects of different flow rates on the relative correction factors (n=5)

  

2.7 待测成分色谱峰的定位

目前常用的色谱峰定位方法有相对保留值法、保留时间差法、时间校正法、对照提取物法等[12]。保留时间差法计算公式为Δti/s=ti-ts。相对保留值法计算公式为ti/s=ti/ts。本文采用相对保留值法，以蔓荆子黄素为内参物，考察其他4个成分在不同超高效液相色谱仪Waters H-Class型、Thermo Vanquish型，以及不同色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column、Shimadzu Shim-pack Scepter C₁₈-120、YMC Triart C₁₈ Column下的相对保留值，结果见表6。各成分相对保留值的RSD均小于3.0%（n=6），表明不同色谱系统和色谱柱对各成分相对保留值无明显影响。

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  表格6 不同色谱仪和色谱柱对相对保留值的影响（n=6）

  Table 6.Effect of different chromatograph and columns on relative retention values (n=6)

  

2.8 QAMS法与EMS法测定结果比较

取10批蔓荆子配方颗粒适量（S1~S10），精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别采用外标（ESM）法和QAMS法测定各成分含量，利用SPSS 26.0软件对这两组结果进行Pearson相关性分析和配对样本t检验[13]，结果见表7。2种方法之间的相关系数r均为1.000，t检验结果显示，2种方法所得结果差异无统计学意义（P＞0.05）。

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  表格7 蔓荆子配方颗粒中5个成分的含量测定结果（%）

  Table 7.Results of determination of five components in the viticis fructus formula granules (%)

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验证ESM法和QAMS法测定蔓荆子配方颗粒中原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸和异荭草素的含量，计算2种测定方法下的相对误差，根据公式：相对误差=（QAMS含量－ESM含量）÷QAMS含量×100%[14]，结果显示原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、异荭草素的测定相对误差范围分别为0.12%~1.17%，0.04%~0.61%，0.17%~1.33%，0.20%~2.04%，表明两种方法测定结果差异无统计学意义（P＞0.05），建立的QAMS法具有较好的可信度。

3 讨论

本研究在参考广东省中药配方颗粒质量标准《蔓荆子（单叶蔓荆）配方颗粒》（编号：粤PFKL20210162）的基础上，分别考察了50%甲醇、80%甲醇及甲醇等不同提取溶剂，发现广东省质量标准方法可以较全面的兼顾5种成分，所制备的供试品溶液图谱分离度良好，杂质干扰峰较少，且该方法简单，故将甲醇作为本研究中供试品溶液制备的提取溶剂。

中药及其制剂所含成分复杂，单一成分的定量检测难以把控其整体质量，为实现对中药及其制剂质量的整体和全面综合评价，常借助现代各种分析技术和方法，近年来出现的新的中药质量控制方法主要有化学模式识别、中药指纹图谱技术、有效成分与药效结合、QAMS法及其类似方法等[15]。相比于传统的ESM法，本研究所用的QAMS法同时测定多指标成分的质量评价模式，有效降低了检验成本、提高了检测效率，解决了部分对照品稀缺或不稳定等不足，近年来已逐步应用于中药及其制剂和中成药复方制剂质量控制当中[16]。

蔓荆子含有多种有效成分，具相关文献[3]报道，其中所含的原儿茶酸具有抗菌、抗炎、抗氧化、抑制肿瘤、镇痛、保护缺血和缺氧神经元细胞等作用，对羟基苯甲酸具有神经保护和抗炎作用，蔓荆子黄素具有抗炎、抗氧化、镇痛、抗肿瘤、免疫调节的作用。本研究采用QAMS法同时测定了蔓荆子配方颗粒中5种有效成分的含量，并对QAMS法的可行性与适用性进行了探讨，计算结果与外标法实测含量结果无明显差异性，不同色谱系统、色谱柱、柱温及流速等因素对相对校正因子无明显影响，各待测成分色谱峰的相对保留时间均稳定，说明建立的QAMS法科学、可靠，可为蔓荆子配方颗粒多指标质量控制研究提供参考依据。

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