目的  利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析消石利胆丸的化学成分，结合网络药理学和分子对接技术探讨消石利胆丸治疗胆石症的作用机制。方 法  通过UPLC-MS/MS分析和对照品比对，分析消石利胆丸的药效成分；通过检索中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）、中医百科全书（ETCM）数据库获得成分的潜在作用靶点，应用DisGeNET数据库挖掘胆石症相关疾病靶点，两者交集得到潜在作用靶点并导入String数据库，建立靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，应用Cytoscape 3.9.1构建“药物-成分-靶点”网络；对核心靶标进行GO和KEGG富集分析，最后选取活性强度前5位的化合物作为配体与筛选后的疾病靶点基因进行分子对接，并通过RAW264.7细胞验证抗炎活性，RT-PCR法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子mRNA表达情况。

结果  UPLC-MS/MS筛选出消石利胆丸中30个化合物，其中汉黄芩素、槲皮素、黄芩素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、大黄素为消石利胆丸的关键成分。网络药理学筛选得到与胆石症相关靶点107个，其中血清白蛋白、细胞肿瘤抗原p53、雌激素受体、TNF、胰岛素为其核心靶点。GO分析表明作用于炎症反应、类固醇结合等，KEGG主要涉及脂质和动脉粥样硬化、TNF信号通路等。分子对接分析和体外抗炎活性筛选显示消石利胆丸通过黄芩素、槲皮素、大黄素等成分调控TNF等相关炎症因子抑制一氧化氮的生成，具有一定的抗炎活性。

结论  消石利胆丸通过黄芩素等成分调控TNF等相关通路抑制炎症反应，从而起到治疗胆石症的效果。

胆石症是一种常见的消化系统疾病，临床以腹部剧痛、发热、黄疸等为主要症状，其病因复杂，致病因素多过程复杂，如基因因素、环境因素、代谢过程、胆囊功能、生活习惯等均会造成胆囊结石[1]。中医学中并无胆石症病名，而是将其归类于“胆胀”“胁痛”“黄疸”等之中，认为胆石症是由湿热浊毒与胆汁相互作用而成 [2]。近年来，胆囊结石的发生率显著增高[3]，手术治疗是目前最主要、最有效的方法，但术后残石率及复发率较高[4]。消石利胆丸由柴胡、枳实、白芍、木香、黄芩、郁金、鸡内金、厚朴、焦山楂、大黄等组成，来源于武汉市中医医院临床经验方，主要用于治疗胆石症、胆囊炎所致胆绞痛、大便秘结、厌油、寒颤高热，以及结石引起的阻塞性黄疸等症。方中柴胡、郁金、枳实疏肝行气，白芍缓肝和中，黄芩、大黄苦寒利胆，鸡内金健脾消积，山楂入肝导滞，厚朴宽中理气，共奏疏肝利胆之功效[5]。多年临床用药发现，该制剂具有良好的消石作用，可明显加快胆汁排出量，显著促进胆囊平滑肌收缩，从而促使炎症产物或结石的排出，改善临床症状 [5]。因前期对该制剂研究不够深入，使其在二次开发上面临诸多困难，因此急需对其进行系统研究，以期为后续医疗机构制剂的转化奠定基础。

超高效液相色谱-串联质谱（ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）具有高灵敏度、高分辨率、高分离度等优点，能够准确地鉴定复方化学成分。网络药理学是一门新兴的生信学科，其以网络的形式探究疾病机制和药物作用机制，同时包含了医学、生物学、计算机科学、生物信息学等多学科基础理论，能够系统地预测中药有效活性成分及药物作用机制[6]。中药讲究配伍，擅长使用药物之间的相互协调制衡以达到治疗调和作用，这一点恰好与网络药理学多靶点、多途径、协调作用相对应。基于此，本研究应用网络药理学和分子对接技术联合UPLC-MS/MS，探究消石利胆丸治疗胆石症所参与的活性成分作用于胆石症相关靶点的过程或机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

ExionLC™ AD超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（美国科学出口公司）；Scientz-100F冻干机（宁波新芝生物科技有限公司）；莱驰MM  400研磨仪（德国莱驰公司）；MS105DΜ电子天平（瑞士梅特勒公司）；5804r离心机（德国艾本德公司）；酶标仪（美国伯腾公司）；PCR仪（瑞士罗氏公司）。

1.2 主要药品与试剂

大黄素对照品（批号：C18F8Q29652，纯度98.0%）、黄芩素对照品（批号：C07M10Y87479，纯度98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；槲皮素对照品（成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，批号：RDD-H00902210024，纯度98.0%）；DMEM高糖培养基（北京素莱宝科技有限公司，批号：20210325）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20080502）；CCK-8试剂盒（白鲨兰杰柯科技有限公司，批号：P23000015343）；脂多糖（德国默克公司，批号：0000185317）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司，批号：061322221109）；TRIzol[天根生化科技（北京）有限公司，批号：X1215]；反转录试剂盒（批号：962329F26W06）和Real Universal荧光定量试剂SYBR Green（批号：962303F08W09）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水；消石利胆丸（批号：202111262）由武汉市中医医院提供。  

1.3 细胞

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7由华中科技大学同济医学院免疫学教研室馈赠；引物由上海生物工程股份有限公司合成；样品成分定性和定量分析由迈维代谢完成。

1.4 方法

1.4.1 样品提取

样品置于冻干机中干燥后，用研磨仪研磨（频率：30 Hz）1.5 min至粉末状。称取50 mg粉末，加入1 200 μL预冷的70%甲醇水内标提取液，每30 min涡旋1次，每次持续30 s，共涡旋6次，15  294×g离心3 min后吸取上清，于0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。

1.4.2 色谱条件

色谱柱为Agilent SB-C18柱（100 mm× 2.1  mm，1.8 µm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）- 0.1%甲酸乙腈溶液（B），洗脱梯度（0~9.0 min，5%~95%B；9.0~10.0 min 95%B；10.0~11.1 min，95%~5%B；11.1~14.0 min，5%B）；流速：0.35  mL· min^-1；柱温：40 ℃；进样量：2 μL。

1.4.3 质谱条件

采用电喷雾离子源，温度：550 ℃；离子喷雾电压：5 500 V（正离子模式）/-4 500 V（负离子模式）；离子源气体I、气体II和气帘气分别设置为50、60、25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高；三重四极杆扫描采用多反应监测模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等；通过进一步的去簇电压和碰撞能优化，完成了各个多反应监测离子对的去簇电压和碰撞能；根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测1组特定的多反应监测离子对。

1.4.4 化学成分分析

基于迈维代谢自建数据库MetWare database，根据二级谱信息进行物质定性，利用三重四级杆质谱的多反应监测定量分析，采用Analyst 1.6.3软件处理质谱数据。

1.4.5 消石利胆丸治疗胆结石的网络药理学预测

（1）消石利胆丸成分靶点与相关疾病靶点收集。应用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/index.php）以及中医药百科全书数据库（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）检索UPLC-MS/MS检测平台所得物质对应靶点。将靶点导入String数据库（https://cn.string-db.org/）对所得成分靶点进行规范验证得到官方基因名称并联合UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）查缺补漏，补全成分靶点基因名称。采用疾病靶点数据库（DisGeNET，https://www.disgenet.org/）检索胆石症及其相关病症如“gallstone”“Cholelithiasis”“cholecystitis”等，获得胆石症相关靶点。

（2）韦恩图及成分靶点网络图构建。将所得成分靶点以及胆石症相关靶点分别导入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）作图并取交集，交集靶点即为消石利胆丸治疗胆石症潜在作用靶点。将成分与靶点分类整理之后导入Cytoscape 3.9.1软件，搭建消石利胆丸治疗胆石症的成分-靶点网络图。

（3）消石利胆丸-胆石症靶点蛋白互作网络构建。将交集靶点导入String数据库，设置物种类型为“Homo sapiens”，其他均为默认值，分析构建蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）。下载数据导入Cytoscape 3.9.1软件，绘制PPI网络图，使用软件插件CytoNCA分析PPI网络筛选出核心靶点。

（4）基于DAVID生物数据库关键靶点的GO富集分析和KEGG富集分析。将交集靶点导入DAVID生物数据库（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/）对相关靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，以深入探究消石利胆丸与胆石症交集靶点在信号通路中的作用方式，作用路径及生物过程等。

1.4.6 关键成分与核心靶点的分子对接验证

将成分与靶点分类整理之后导入Cytoscape 3.9.1软件，使用CytoNCA分析，以介数中心性为参照筛选出前5位核心成分；同时将得到的前5位核心靶点再次导入String数据库检索相关蛋白并结合文献确定蛋白质结构数据库（RCSB Protein Data Bank，RCSB PDB）编号并下载，导入AutoDockTools 1.5.7软件对蛋白分子删减水分子和加氢；应用TCMSP数据库和PubChem数据库检索得到相关成分分子的3D结构文件，导入AutoDockTools 1.5.7软件准备对接前的处理；进行半柔性分子对接后计算最低结合能保存结果后，导入PyMOL进行可视化处理。

1.4.7 关键成分的抗炎活性验证

（1）CCK-8法检测RAW264.7细胞存活率。RAW264.7细胞培养条件为含10%胎牛血清、1%双抗的高糖 DMEM培养液、于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养；取对数生长期的细胞接种于96孔板中，接种密度为1×104个/孔，24  h后分别换成含黄芩素（25、50、100 μmol·L^-1）、槲皮素（25、50、100 μmol·L^-1）、大黄素（25、50、100  μmol·L^-1）、消石利胆丸提取物（25、50、100  μg·mL^-1）的DMEM培养液，继续孵育24 h后，弃上清，加10 μL的CCK-8，90 μL培养基继续孵育0.5 h后，酶标仪检测各孔570 nm的吸光度（A）值，根据公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（1-实验组A值/对照组A值） × 100%（对照组不含药物）。

（2）Griess法检测RAW264.7细胞NO分泌量。将RAW264.7细胞以2×105个/孔的密度接种于24孔板中，培养24 h后，细胞培养液更换为含各浓度药物的DMEM 培养液（根据MTT细胞活力实验选择浓度分别为50、25、12.5  μmol·L^-1），并加入1 μg/mL脂多糖刺激细胞分泌NO，每组3个复孔；继续培养24 h后，收集细胞培养上清，按照NO 检测试剂盒检测NO生成量，计算NO释放率：NO释放率（%）=（样品孔A值－空白孔A值）/（对照孔A值－空白孔A值）×100%（对照孔不含药物）。

（3）RT-PCR检测TNF-α mRNA表达水平。给药4 h后，收集细胞，使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，进行qRT-PCR分析，反应体系20 μL，PCR扩增反应条件为：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 32 s，共40个循环，并采用2-△△CT计算mRNA相对表达量。引物序列如下：β-actin：上游CCTGACTGACTACCTCATGAAG，下游GACGTAGCACAGCTTCTCCTT；TNF-α：上游CTGGTATGAGCCCATCTATC，上游CGAAGTGGTGGTCTTGTTG。

2 结果

2.1 消石利胆丸的化学成分分析

消石利胆丸在正负离子模式下的总离子流见图1，初步鉴定出多个化合物，包括酚酸类、木脂素类、萜类、生物碱、蒽醌、香豆素等多种类型。结合峰面积数据，中国药典及各级标准中规定的化学成分，并采用标准品比对，共筛选出30个化合物，具体峰面积数值以及对应成分名称等信息见表1。

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  图1 消石利胆丸正（A）、负（B）离子模式下的总离子流图

  Figure 1.Total ion current diagram of Xiaoshi Lidan pills in positive (A) and negative (B) ion mode

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  表格1 消石利胆丸中化学成分的UPLC-MS/MS分析

  Table 1.UPLC-MS/MS analysis of chemical components in Xiaoshi Lidan pills

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2.2 消石利胆丸活性成分靶点

2.2.1 消石利胆丸治疗胆石症靶点预测

将筛选到的化合物经过TCMSP数据库和ETCM数据库检索共得到靶点并去除重复后共315个。应用DisGENT数据库检索后得到胆石症有关疾病基因去除重复后1 373个，与同样去除重复后的成分基因进行匹配最终得到107个交集基因并绘制Venn图（图2），此为预测的消石利胆丸治疗胆石症潜在靶点。将成分与靶点整理后导入Cytoscape 3.9.1 软件，绘制“消石利胆丸-活性成分-靶点”网络图（图3），介数中心性[7]排名前5的有汉黄芩素、槲皮素、黄芩素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、大黄素，表明这几种成分在消石利胆丸治疗结石症中可能起着重要作用。

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  图2 消石利胆丸成分靶点与胆石症疾病靶点Venn图

  Figure 2.Venn diagram of Xiaoshi Lidan pills ingredient targets and cholelithiasis disease targets

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  图3 消石利胆丸-活性成分-靶点网络图

  Figure 3.Xiaoshi Lidan pills-active ingredient-target network diagram

  注：左边外圈代表中药编号（见表1），内圈代表消石利胆丸，右边方形代表靶点基因。

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2.2.2 消石利胆丸治疗胆石症靶点的PPI网络搭建与分析

将交集所得107个靶点上传到String数据库选择TSV文件并下载，将文件导入Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图（图4）。以介数中心性为指标，得到排名前10的的靶点（表2），这些靶点为消石利胆丸治疗胆石症的关键靶点。

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  图4 消石利胆丸治疗胆石症靶点的PPI网络

  Figure 4.PPI network of targets for Xiaoshi Lidan pills to treat cholelithiasis

  注：圆圈代表靶点，连线代表靶点间存在相互作用关系，颜色越深代表相互作用关系越紧密。

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  表格2 介数中心性排名前10的的靶点

  Table 2.Top 10 targets of betweenness

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2.2.3 消石利胆丸治疗胆石症靶点的GO功能富集及KEGG通路富集分析

采用DAVID数据库对107个交集靶点进行GO富集分析得到结果（图5），相关生物过程556个，主要有基因表达的正向调控、炎症反应、转录的正向调节，DNA模板化、细胞对脂多糖的反应等过程。包括细胞组成44个主要为细胞外域、细胞外外泌体、大分子复合物、染色质等细胞成分。涉及分子功能109个，主要为酶结合、类固醇结合、相同的蛋白质结合、转录共激活因子结合等分子功能。同时使用DAVID数据库对107个交集靶点进行KEGG通路富集分析得到信号通路163条，以P为参照筛选前40条通路（图5），结果显示消石利胆丸治疗胆石症主要富集于糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体（AGE-RAGE）信号通路、脂质和动脉粥样硬化、白细胞介素-17（IL^-17）信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、TNF信号通路等通路上发挥作用。结果表明消石利胆丸通过作用于多条通路对胆石症进行预防与治疗。

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  图5 消石利胆丸治疗胆石症靶点GO和KEGG分析图

  Figure 5.GO and KEGG analysis chart of Xiaoshi Lidan pills' targets for treating cholelithiasis

  注：A. GO的富集分析；B. KEGG的富集分析。

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2.3 消石利胆丸治疗胆石症靶点的分子对接分析

以介数中心性为参照筛选出的核心靶点与核心活性成分进行分子对接，进一步验证消石利胆丸治疗胆石症的作用及机制（表3）。研究报道结合能绝对值＞5.00 kcal·mol-1代表结合稳定，＞7.00  kcal·mol-1代表具有强烈的结合活性。活性成分与靶点TNF（7KPA）结合能均大于7.00  kcal·mol-1（图6），黄芩素、大黄素与靶点结合能均大于5.00 kcal·mol-1。分子对接结果表明消石利胆丸活性成分与胆石症靶点有良好的结合能力。

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  表格3 活性成分与相关靶点分子对接最低结合能（kcal·mol-1）

  Table 3.Minimum binding energy of docking active ingredients and related target molecules (kcal·mol-1)

  注：*为蛋白RCSB PDB编号。

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  图6 汉黄芩素、槲皮素、黄芩素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、大黄素与TNF对接模式图

  Figure 6.Diagram of the docking model of wogonin, quercetin, baicalein, luteolin-7-O-glucuronide, emodin and TNF

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2.4 消石利胆丸和关键成分的抗炎活性验证

2.4.1 消石利胆丸和关键成分对细胞存活率的影响

50 μg·mL^-1以下的消石利胆丸提取物、槲皮素和大黄素在50 μmol·L^-1下细胞存活率均大于90%，无明显细胞毒性；大黄素在100 μmol·L^-1有一定的细胞毒作用，结果见图7。

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  图7 消石利胆丸和关键成分对细胞存活率的影响

  Figure 7.Effects of Xiaoshi Lidan pills and key components on cell survival rate

  注：与对照组相比较，**P<0.01。

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2.4.2 消石利胆丸和关键成分对NO分泌量的影响

结果见图8，脂多糖可显著促进RAW264.7细胞NO的释放（P＜0.01），说明模型诱导成功。与模型组相比，消石利胆丸提取物可显著抑制LPS诱导NO产生（P＜0.01），具有一定的剂量依耐性。槲皮素、黄芩素和大黄素等均可抑制NO生成，其中槲皮素的抑制效果较好，3个浓度的抑制率均大于50%。

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  图8 消石利胆丸和关键成分对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的影响

  Figure 8.Effects of Xiaoshi Lidan pills and key ingredients on NO production in LPS-induced RAW264.7 cell

  注：与模型组相比较，**P<0.01。

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3 讨论

胆石症根据结石部位可分为胆囊结石、肝外胆管结石及肝内胆管结石，其中胆囊结石最为常见，约占50%[8-9]。细菌、寄生虫等诱发胆囊胆汁代谢障碍致使胆汁淤滞、阻碍胆道或者胆囊收缩能力降低等，不利于胆汁排泄，从而导致胆囊炎、胆石症[5]。中医将胆结石归类于“胆胀”“胁痛” “黄疸”等之中，认为胆石症的病因与肝郁气滞、饮食不节及内伤湿热有关，因而疏肝利胆、清热化湿是临床最常用的方法 [2,  5]。消石利胆丸由柴胡、大黄、白芍、黄芩、郁金、厚朴、木香、枳实、山楂、鸡内金、麦芽等多味药组成，其中柴胡、郁金、枳实疏肝止痛，白芍缓肝和中，黄芩、大黄为苦寒之物清热利胆，山楂、鸡内金、麦芽健脾消食，厚朴宽中理气，配伍可行疏肝利胆之效。

本研究通过UPLC-MS/MS检测结合文献调研，从消石利胆丸中筛选鉴定出30个活性成分，并采用网络药理学筛选得到与胆石症相关靶点107个，其中汉黄芩素、槲皮素、黄芩素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、大黄素、柴胡皂苷D、肉桂醛、去氢木香内酯等是治疗胆石症的关键成分。有研究显示胆石症患者TNF-α、IL-6、CA19-9等炎症因子水平明显升高，表明这些炎症因子与胆石症有着密切联系[10]。黄芩苷和柚皮苷可抑制促炎因子，促进抗炎因子水平[11-12]；汉黄芩素可以有效抑制TGF-β1表达，改善肾结石大鼠的生化指标及病理状况，且浓度越高效果越好[13]；槲皮素是一种能够选择性抑制环氧化酶-2活性及巨噬细胞炎症反应的化合物[14]；另有相关实验证明大黄素可以使小鼠体内IL-6、TNF-α、IL^-1β等炎症因子水平降低而具有较强的抗炎效果[15]。

GO富集分析发现，消石利胆丸相关靶点通过炎症反应、与类固醇结合等分子功能发挥作用。KEGG富集分析结果显示，消石利胆丸主要作用于脂质和动脉粥样硬化、IL^-17信号通路、TNF信号通路等发挥作用。通过PPI网络分析可以得知ALB、TP53、ESR1、TNF、INS为消石利胆丸治疗胆石症核心靶点。ALB是体内主要的蛋白质，具有维持血浆胶体渗透压、结合运输物质等功能[16]；TP53可以调控胆囊癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，从而参与胆囊癌的发生发展[17]；雌激素能够与肝中的ESR1结合，刺激体内的胆固醇分泌，增加胆汁中的胆固醇，导致肝脏中胆汁的积聚和胆结石的形成[18]；TNF-α由脂肪组织分泌产生，研究显示胆石症患者体内TNF-α的表达与胆囊壁白细胞数量呈正相关，而慢性胆石症患者TNF-α的表达高于急性胆囊炎患者[19]。因而，消石利胆丸有效活性成分可通过与以上靶点结合而发挥治疗胆结石作用。分子对接分析显示蛋白TNF-α与黄芩素的最低结合能绝对值最大，且与汉黄芩素、槲皮素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、大黄素对接结合能绝对值均大于其他蛋白，表明消石利胆丸可能通过抑制TNF-α基因表达的作用从而起到预防治疗胆石症的效果。

综上所述，消石利胆丸中发挥主要作用的活性成分包括汉黄芩素、槲皮素、黄芩素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、大黄素等，核心靶点为ALB、TP53、ESR1、TNF、INS等。GO分析表明通过炎症反应、类固醇结合等发挥作用，KEGG主要涉及脂质和动脉粥样硬化、TNF等信号通路。同时分子对接和体外抗炎活性筛选结果显示，消石利胆丸通过黄芩素、槲皮素、大黄素等成分调控TNF等相关通路抑制炎症反应，从而起到治疗胆石症的效果，体现了中药复方治疗疾病多成分、多靶点、多途径的特点。

尽管如此，本实验通过网络药理学预测出的机制仅局限于动物基因水平上，没有在动物蛋白水平进行验证同时未搭建体内动物模型来验证预测，后续还需设计相关实验证实结论；同时，本次研究仅用对照品从液质1 617个成分筛选主要的活性成分进行网络药理学分析预测，不能充分研究消石利胆丸对胆石症的治疗机制，后续还需扩大范围进行更充分的分析。

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