目的  基于熵权法结合星点设计-效应面法（CCD-RSM）和误差反向传播人工神经网络（BP-ANN）建模优化黄连-黄柏的提取工艺。

方法  采用HPLC测定表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的含量，应用UV测定总生物碱的含量，并计算提取量。采用信息熵理论对上述5个指标的的提取量与干膏得率进行综合评分，以CCD-RSM的13组数据作为训练数据，采用BP-ANN进行建模及分析，以综合评分作为考察指标，仿真模拟预测黄连-黄柏最佳提取工艺参数。

结果  最佳提取工艺为加11倍量水煎煮2次，每次煎煮95 min，此时综合评分达到最大值106.41。

结论  BP-ANN建立的数学模型具有良好的预测性，优化的提取工艺高效、稳定、可行。

三黄膏由黄连、黄柏、黄芩等药味组成，具有清热止痛、去腐生肌之功效，用于痔瘘、肌肉腐烂等症的治疗。目前三黄膏制备工艺采用全方粉碎入药，由于药材自身纤维性强，即使采用超微粉碎亦难以保证药粉粒度不大于180 μm，从而导致软膏粒度检查难以符合现行药典标准，由此产生了药品质量风险。本研究拟将处方中黄连、黄柏、黄芩进行提取，从根本上解决粒度检查超限的问题。研究[1-2]发现，黄芩与黄连、黄柏配伍后均产生了明显的自沉淀现象，沉淀主要是黄芩苷、汉黄芩苷、小檗碱、黄连碱等成分，故本研究将黄连与黄柏合提，采用误差反向传播人工神经网络（BP-ANN）结合星点设计-效应面法（CCD-RSM）优化黄连-黄柏的提取工艺。信息熵理论是一种客观赋权方法，根据各指标的数据的分散程度，计算出各指标的熵权，从而得到较为客观的指标。ANN作为一种机器学习的算法，是对人脑组织结构和运行机制的某种抽象、简化和模拟，属于人工智能领域。它以网络拓扑知识为理论基础，采用数学模型模拟大脑神经网络结构和功能。本研究在不增加试验次数的前提下，对加水量、煎煮时间等提取工艺参数及综合评分进行仿真模拟预测，以期为后续成型研究打下坚实基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

PerkinElmer A-10型高效液相色谱仪（美国PerkinElmer公司）；UV-2700紫外可见光分度计（日本岛津公司）；LX120A电子天平（0.000 1g）、EP125SM电子天平（0.01 mg）均购于普利赛斯国际贸易有限公司；DHG-9145A型电热鼓风干燥烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药

黄连（批号：201102）购自安徽省神草堂国药有限公司、黄柏（批号：210⁶26）购自甘肃康乐药业有限责任公司，经甘肃省中医院李俊江主任中药师鉴定，符合中国药典2020年版黄连、黄柏药材项下有关规定；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110713-201814，纯度86.7%）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、盐酸、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠、磷酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总生物碱含量测定方法学考察

2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取盐酸小檗碱2.60 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得10⁴.00 μg·mL^-1盐酸小檗碱对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

黄连-黄柏的提取液适当浓缩后定容至500 mL，精密量取5 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100 ∶ 1）的混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率：200 W， 频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

2.1.3 最大吸收波长的确定

精密量取对照品溶液0.2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度；以甲醇-盐酸（100 ∶ 1）混合溶液为阴性溶液，在190~500 nm波长下进行扫描，同时参考中国药典2020年版黄连项下含量测定方法[3]，确定检测波长为345 nm，且阴性溶液[甲醇-盐酸（100 ∶ 1）]无吸收。

2.1.4 标准曲线的绘制

精密量取“2.1.1”项下的对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL分别置10 mL量瓶中，补足甲醇至刻度，得1.04，2.08，4.16，6.24，8.32，10.40，12.48，14.56 μg·mL^-1的对照品溶液，于波长345 nm处测吸光度，以吸光度（A）为纵轴，以总生物碱含量（C，μg·mL^-1）为横轴，得回归方程A=0.056 7C+0.076 3，r=0.999 9，说明盐酸小檗碱在1.04~14.56 μg·mL^-1范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

取浓度为8.32 μg·mL^-1的对照品溶液适量，在345 nm波长下测定吸光度，结果RSD=0.74%（n=5），结果表明该仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取同一批提取液（批号：220501），按“2.1.2”项下方法平行制备5份供试品溶液，在345 nm波长下测定吸光度，结果平均含量为5.80 mg·mL^-1，其RSD=2.07%（n=5），表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验

取提取液（批号：220501），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在345 nm波长下分别在0，0.5，1，1.5，2 h测定吸光度，结果RSD=1.91%（n=5），说明供试品溶液在2 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验

精密量取已知总生物碱含量（3.54 mg·mL^-1）的提取液1 mL共9份，分别具塞锥形瓶量瓶中，加入盐酸小檗碱对照品溶液（2.03mg·mL^-1）1.40，1.40，1.40，1.75，1.75，1.75，2.10，2.10，2.10 mL，用超纯水补至5 mL，按“2.1.2”项下方法从“精密加入甲醇-盐酸（100 ∶ 1）......”开始制备供试品溶液，在345 nm处测定吸光度。平均加样回收率为101.94%，RSD=2.07%（n=9）。

2.2 生物碱含量测定方法学考察

该研究参照中国药典2020年版一部黄连项下含量测定方法，采用“一测多评法”对提取液中的表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的含量进行测定。

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C₁₈柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（50 ∶ 50）（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g与磷酸0.4 mL）；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：345 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL[3]。

2.2.2 对照品溶液的配制

见“2.1.1”项下配制操作。

2.2.3 供试品溶液的制备

按“2.1.2”项下方法，从“提取液适当浓缩后定容至500 mL......”开始操作，制备，取续滤液，即得。

2.2.4 缺黄连阴性样品溶液的制备

取黄柏10 g，加9倍量水煎煮2次，每次煎煮60 min；合并2次煎液，定容至500 mL，即得缺黄连阴性药液，按照“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 专属性考察

取盐酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液、缺黄连阴性样品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱与其他组分能够达到基线分离，4个成分与盐酸小檗碱的相对保留时间符合药典要求，且阴性样品对表小檗碱、黄连碱、巴马汀的测定无干扰，表明该方法专属性良好。HPLC色谱图见图1。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatograms

  注：1.表小檗碱；2.黄连碱；3.巴马汀；4.盐酸小檗碱

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2.2.6 线性关系考察

取“2.1.1”项下对照品溶液分别自动进样1，5，10，15，20 μL，再按“2.2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品含量（X，μg）为横坐标进行回归分析。标准曲线为Y=3.31×10⁶X+4.74×10⁴（r=0.999 9），线性范围0.10⁴~2.080 μg。

2.2.7 精密度试验

取“2.1.1”项下对照品溶液按“2.2.1”项下色谱条件连续进样5次，结果峰面积的RSD=1.01%（n=5），表明该仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验

取同一批提取液（批号：220501），按“2.2.3”项下方法平行制备5份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析，结果小檗碱平均含量为3.11 mg·mL^-1，RSD=1.15%（n=5），表明该方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验

取同一批提取液（批号：220501），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在0，6，12，18，24 h进样分析，结果峰面积的RSD=1.51%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.10 加样回收率试验

精密量取已知小檗碱含量（1.88 mg·mL^-1）的提取液1 mL共9份，分别具塞锥形瓶量瓶中，加入盐酸小檗碱对照品溶液（2.03 mg·mL^-1）0.75，0.75，0.75，0.92，0.92，0.92，1.10，1.10，1.10 mL，用超纯水补至5 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。平均加样回收率为101.85%，RSD=1.98%（n=9）。

2.3 干膏得率测定方法

精密吸取提取液10 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，在105℃干燥3 h，在干燥器中冷却30 min，迅速称定质量，计算干膏得率[4]。计算公式如下：干膏得率=（m×V）/（10×W）×100%，式中：m为10 mL提取液中干浸膏质量；V为药液体积；W为饮片质量。

2.4 星点设计－效应面法优化黄连-黄柏提取工艺

2.4.1 星点设计-效应面试验设计

比较了不同提取次数对生物碱提取量的影响，发现第3次提取对生物碱提取量的贡献较小，考虑到节能降低成本，确定提取次数为2次。以表小檗碱（Y₁）、黄连碱（Y₂）、巴马汀（Y₃）、小檗碱（Y_4）、总生物碱（Y_5）、干膏得率（Y₆）为评价指标，对加水量（A）、煎煮时间（B）两个因素进行考察[5-6]。因素水平表见表1，试验设计与结果见表2。

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  表格1 星点设计-效应面试验因素与水平

  Table 1.Factors and levels of CCD-RSM

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  表格2 星点设计-效应面试验设计与结果

  Table 2.Experimental design and results of CCD-RSM

  

2.4.2 数据处理与分析

信息熵理论的核心思想是根据指标变异性大小确定客观权重。某一评价指标的信息熵Hi越小则表明其变异程度越大，在综合评价中所占的权重越大，权重大小以权重系数Wi表示[5-7]。根据以下3个公式计算各指标权重系数：

式中：m是评价指标数量，n是试验次数，x_ij是第j次试验在第i个评价指标下的原始数据；P_ij是第j次试验在第i个评价指标下的概率。

计算结果：6个指标的权重系数Wi依次为：W₁=0.248 2，W₂=0.169 0，W₃=0.199 2，W₄=0.147 8，W₅=0.139 7，W₆=0.096 0。

对表2中13组试验数据进行加权处理得到综合评分M，结果见表2。计算公式如下:

   M=(Y₁/Y_1max×W₁+Y₂/Y_2max×W₂+Y₃/Y_3max×W₃+Y₄/Y_4max×W₄+Y₅/Y_5max×W₅+Y₆/Y_6max×W₆）×100

采用Design-Expert V 8.0软件对综合评分M进行二次多元回归拟合，回归方程：

   M=82.86+7.87A+13.31B+1.51AB-1.46A²-4.02B²（R²=0.972 2，P＜0.000 1）

试验所得模型P＜0.000 1，表明试验模型显著；失拟项（P=0.983 8）不显著，表明模型与试验因素拟合程度较好。以P考察各因素对M的影响程度，其中A、B、B²均P＜0.01，对M具有显著影响，结果见表3。根据二项式方程回归模型，绘制二维与三维效应面图，结果见图2。

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  表格3 方差分析结果

  Table 3.Analysis result of variance

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  图2 两个因素交互作用的等高线图与三维效应面图

  Figure 2.Two effects surface map and contour map of each matrix ratio

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通过Design-Expert V 8.0软件对所建立的二次回归方程进行求解，得到最佳的提取工艺：加12倍量水煎煮2次，每次煎煮90 min，此时M值达到最大值100.06。

2.5 BP-ANN模型建立及预测分析

2.5.1 BP-ANN训练样本与初始参数的确定

以CCD-RSM的13组数据用来训练ANN。BP-ANN输入层共有2个节点：加水量、煎煮时间，输出层为1个节点是M。应用Matlab软件神经网络工具箱（R2012a版），设置13组数据中的9组数据作为训练数据样本，2组数据作为验证数据样本，2组数据作为测试数据。隐含层设置为1个，隐含层神经元数量可根据Kolmogorov定理确定，即，n2是隐含层神经元数目，n1是输入层节点数目，m是输出层节点数目，a是介于1~10的常数。经过测试发现隐含层神经元数量达到12个时，网络训练精度满足要求，训练算法选择软件默认的Levenberg-Marquardt[7-11]。训练结果见图3。

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  图3 BP-ANN训练过程与结果

  Figure 3.Training process and result of BP-ANN

  注：A.训练回归曲线；B. 验证回归曲线；C.测试回归曲线；D.总回归曲线

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结果表明，训练回归曲线相关系数r=0.982 7，验证回归曲线相关系数r=1.000 0，测试回归曲线相关系数r=1.000 0，总回归曲线相关系数r=0.982 5。当r值越接近于1，说明拟合程度越好[12-13]。上述结果证明建立的BP-ANN模型可以对黄连-黄柏提取工艺进行预测。

2.5.2 BP-ANN仿真模拟预测

固定2个因素中任意1个的水平值，以适宜的梯度改变剩余因素的水平值，采用y=sim(net，x)（其中y为预测值，x为上述2个因素不同水平值的组合）代码进行仿真模拟预测，寻找最佳提取参数[9]。BP-ANN优化的黄连-黄柏提取工艺为加11倍量水煎煮2次，每次煎煮95 min。此时M达到最大值10⁶.41。

2.6 提取工艺验证试验

平行各取3份黄连-黄柏饮片，分别按CCD-RSM、BP-ANN优化的提取工艺进行3次验证试验。结果见表4。

结果表明，BP-ANN优化工艺提取效率略优于CCD-RSM，考虑到生产投料批量及成本因素，黄连-黄柏最优提取工艺为加11倍量水煎煮2次，每次煎煮95 min。

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  表格4 优化提取工艺验证结果及对比

  Table 4.Verification results and comparison of optimized extraction process

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3 讨论

中国药典2020年版一部中黄连含量测定色谱条件项下流动相需要用磷酸调节pH为4.0，实践中发现调节pH的操作较为繁琐，多次尝试后发现每100 mL流动相中加入0.4 mL磷酸，4个生物碱的分离效果良好，故可以采用上述方法代替药典方法。本研究发现不同厂家生产的十二烷基硫酸钠在流动相中的溶解度不同，影响生物碱的分离与测定。

中药所含化学成分是其发挥药效的物质基础，在提取工艺研究中，核心任务是有针对性的将药效物质最大程度的保留下来。黄连、黄柏中所含生物碱类成分具有抑菌、抗炎活性，如对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒杆菌、幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌有明显的抑制生长作用[14-16]。本研究结合黄连、黄柏的药理作用与三黄膏的功能主治，故选择表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱及总生物碱提取量作为优化提取工艺的考察指标。

CCD-RSM在药学试验设计中有广泛的应用，具有操作简单,试验次数较少，既能分析各因素之间的相互作用又能保证试验精度,能弥补均匀设计和正交试验设计的不足。BP-ANN算法在理论上可以逼近任意函数，基本结构由非线性变化单元组成，具有很强的非线性映射能力；其构成原理和功能特点等方面更加接近人脑，能够自身适应环境、总结规律，完成某种运算或过程控制。本研究在CCD-RSM的基础上采用BP-ANN对提取工艺参数和M进行了非线性拟合，训练得到的模型的相关系数r为0.982 7，表明拟合度良好，验证试验与测试试验结果表明仿真模拟预测值与实测值接近，与CCD-RSM相比M值略高。ANN只需要对现有试验数据进行训练学习，在减少试验次数节省试验时间和经费的同时，可以对任意水平组合的提取效果进行预测。

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