目的  研究红芪多糖（HPS）标准提取物，筛选优化其“脱蛋白-大孔吸附树脂纯化富集”的工艺方法与工艺参数。

方法  以蛋白脱除率和多糖损失率为指标，比较4种不同方法的脱蛋白效果，并对筛选出的方法进行工艺参数优化；以吸附量和吸附率为指标，考察4种型号大孔吸附树脂（AB-8、D-101、NKA-9、X-5）对HPS的纯化富集效果，并进行相关工艺参数优化；采用苯酚硫酸法和考马斯亮兰法分别测定多糖和蛋白质含量；采用紫外分光光度（UV）和红外光谱（IR）法比较纯化前后多糖的基本特征。

结果  筛选出的脱蛋白方法为Sevag法，优选的树脂为AB-8大孔吸附树脂。通过工艺参数优选，确定的纯化工艺为：10 mg·mL^-1粗多糖水溶液，以1/2倍体积氯仿-正丁醇（4 ∶ 1，v/v）混合试剂进行脱蛋白操作2次；除去残留有机溶剂后，以质量浓度为1.5 mg·mL^-1的水溶液，上预处理好的AB-8大孔吸附树脂柱[树脂量（g）与上样体积（v）比为1 ∶ 10]，以2.0 mL·min^-1流速循环上样2次，动态吸附后再静态吸附6~8 h，后以30%乙醇1.0 mL·min^-1进行洗脱，至洗脱液无明显碱性酒石酸铜反应，收集洗脱液浓缩至与原药1 ∶ 1，加无水乙醇至含醇量80%，沉淀10 h，抽滤，以无水乙醇、丙酮冲洗沉淀，即得HPS。

结论  验证试验表明，经本工艺纯化富集后，所得HPS样品纯度提高了1.27倍；UV在260，280 nm处未见蛋白质吸收峰；IR表现出更突出的多糖结构特征吸收峰，说明纯化过程有效且未对HPS主要结构产生影响。优选出的HPS脱蛋白和大孔树脂纯化工艺稳定可行，重复性较好，使多糖得到较好的纯化富集，为HPS标准提取物的形成以及其能成为制剂科学化原料药提供了研究基础。

红芪首次出现于《本草经集注》，已有千年的药用历史，其性温、味甘，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿的功效。现代研究[1]表明，红芪有多种生物活性化合物成分，包括多糖、黄酮类、苯丙素、三萜类和微量元素、生物碱、有机酸等；其中红芪多糖（hedysarum polysacchcaide，HPS）生物活性显著，越来越多的学者关注其抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等药理活性作用[2-3]。

作为HPS中药标准提取物的主要杂质之一，蛋白质会干扰多糖的结构和功能特性的测定[4]，影响其功效的发挥，而采用乙醇沉淀多糖时蛋白质也同时沉淀出来，因此纯化多糖时首先要去除蛋白质。本研究以红芪为研究对象，采用水提醇沉法提取粗多糖，对纯化富集的关键因素进行筛选，确定最佳的“脱蛋白-大孔吸附树脂”纯化富集工艺，从而为HPS中药标准提取物的开发利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-3300型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；L104型FTS-3000傅立叶变换红外光谱仪（美国赛默飞世尔）；L104型万分之一分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DD-5M型离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；SB-5200DTD型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ZK-82B型真空干燥箱（上海市实验仪器厂有限公司）。

1.2 试药

红芪药材购自甘肃省陇南市瑞达中药材专业合作社(产地为甘肃陇南武都柏林乡楼儿下村)，经甘肃中医药大学崔治家教授鉴定为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根，符合中国药典2020年版植物来源的规定；D-无水葡萄糖对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21882，纯度≥99%）；牛血清蛋白（上海生工生物工程股份有限公司，批号：20200615）；蒸馏水；氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 红芪多糖含量测定方法

采用苯酚-硫酸法[5]测定多糖含量：以蒸馏水配制0.15 mg·mL^-1浓度的葡萄糖对照品溶液。分别吸取对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于具塞试管，以蒸馏水补至2 mL，分别加5%苯酚1 mL混匀，沿管壁缓慢加入浓硫酸5 mL，静置5 min，振摇，沸水浴反应15 min，迅速冷却至室温；另以蒸馏水加苯酚和硫酸，同上操作为空白对照，在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得线性方程：Y=5.7×10^-3X +0.134，r=0.9968。根据各样品具体情况，分别精密吸取2~8 mL加蒸馏水稀释定容至25 mL量瓶中，以使测量值达到标准曲线线性范围。量取各样品液0.2 mL，以蒸馏水补至2 mL，按标准曲线法测定。计算各多糖含量和损失率。多糖损失率=（脱蛋白前多糖吸光度值－脱蛋白后多糖吸光度值）/脱蛋白前多糖吸光度值×100%。

2.2 红芪多糖中蛋白质含量测定方法

采用考马斯亮蓝G250染色法[6]测定蛋白质含量：以蒸馏水配制浓度为240 μg·mL^-1牛血清白蛋白对照品溶液。分别吸取蛋白对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，以蒸馏水补至1 mL，向各管加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，30℃水浴反应5 min；以蒸馏水为空白，在595 nm处测定吸光度值，以蛋白质质量为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得线性方程：Y=6.9×10^-3X-0.0501，r=0.9947，表明蛋白质在24~148 μg范围内与吸光度具有良好的线性关系。分取各样液0.4 mL，以蒸馏水补至1.0 mL，按标准曲线制备法分别测定。计算蛋白质量和脱除率。蛋白脱除率=（脱蛋白前蛋白吸光值－脱蛋白后蛋白吸光值）/脱蛋白前蛋白吸光值×100%。

2.3 红芪粗多糖制备

红芪药材干燥粗粉50 g，水煎煮3次，每次1.0 h，首次加水12倍，浸泡药材2 h后煎煮，第2、3次均加水10倍量，合并提取液，浓缩至与原料药材1 ∶ 1比例，加无水乙醇至含醇量达77%，醇沉10 h，得棕色黏稠状沉淀。沉淀物以10倍量热水溶解趁热离心（999×g）20 min，上清液冷却后加无水乙醇使含醇量达77%，沉淀10 h; 醇沉物再次以10倍量热水溶解，同样方式进行第3次醇沉，抽滤，以乙醚、丙酮、无水乙醇冲洗沉淀，得灰白色粉末，即为红芪粗多糖[7]。

制备一定浓度（6.50 mg·mL^-1）的红芪粗多糖原液。分别采用“2.1”和“2.2”项下方法，测得其中多糖含量为3.86 mg·mL^-1，占比59.38%，蛋白质含量为0.279 mg·mL^-1，占比4.29%。

2.4 脱蛋白方法的筛选

2.4.1 Sevag法

量取粗多糖溶液25 mL，加等体积氯仿-正丁醇（4 ∶ 1，v/v）混合试剂，剧烈振摇30 min，分出氯仿层，将水层和交界处混悬液离心（999×g）20 min，除去变性蛋白沉淀。上清液浓缩至小体积后以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶，测定多糖及蛋白质含量，并计算多糖脱蛋白率和多糖损失率[8-9]。

2.4.2 三氯乙酸（TCA）法

量取粗多糖溶液25 mL，加原液体积1/10的三氯乙酸振摇，放置12 h，离心（999×g）20 min，取上清液浓缩至小体积后以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶中，测定多糖含量和蛋白质含量，并计算多糖脱蛋白率和多糖损失率。

2.4.3 TCA-正丁醇法

量取粗多糖溶液25 mL，加等体积三氯乙酸-正丁醇（1 ∶ 10，v/v）混合试剂，振摇10 min，离心（999×g）20 min，取上清液浓缩至小体积后以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶中，测定多糖含量和蛋白质含量，并计算多糖脱蛋白率和多糖损失率。

2.4.4 盐酸法

量取粗多糖溶液25 mL，以2 mol·L^-1盐酸调pH至3，放置过夜，离心（999×g）20 min，取上清液浓缩至小体积后以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶中，测定多糖含量和蛋白质含量，并计算多糖脱蛋白率和多糖损失率。

2.4.5 脱蛋白方法比较结果

4种不同方法脱蛋白效果比较见图1-A。结果显示TCA法和TCA-正丁醇法多糖损失较多，且处理后的多糖复溶性明显减弱，可能是TCA作为变性剂与蛋白质结合形成不溶性盐，暴露出更多的疏水基团而聚集沉淀，而蛋白沉淀的同时，吸附了一定量的多糖造成损失。同时高浓度的TCA可以在一定的程度上造成红芪多糖水解，进而引起多糖结构发生变化。盐酸法蛋白脱除率较低，且多糖损失较多，考虑可能是加热去除盐酸时会有部分多糖水解。综合多糖损失率和脱蛋白率考虑，Sevag法脱蛋白效果更佳。文献[10]报道Sevag法脱蛋白原理是利用有机溶剂破坏蛋白质的双层结构，打破其在水溶液中的溶解度平衡和稳定性，导致蛋白质沉淀。相比较其他方法，Sevag法作用温和，对红芪多糖结构影响较小。因此后续选用Sevag法进行单因素脱蛋白条件优化筛选。

2.4.6 单因素试验筛选Sevag法脱蛋白条件

对影响蛋白脱除率及多糖损失率的主要因素（样品溶液浓度、试剂与样品液体积比、萃取次数）进行考察，具体如下[11-12]。

红芪粗多糖原液浓度：分别配制20，15，10，5，1，0.5 mg·mL^-1不同浓度的粗多糖溶液，各取25 mL，加入等体积氯仿-正丁醇（4 ∶ 1，v/v）混合试剂，剧烈振摇30 min，分出氯仿层，将水层和交界处混悬液离心（999×g）20 min，上清液水浴浓缩至小体积后以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶中，测定多糖含量及蛋白质含量。结果见图1-B，原液浓度为10，5，1 mg·mL^-1时，蛋白脱除率较好，多糖损失率相对较低，考虑有机溶剂用量及污染问题，选择原溶液浓度为10 mg·mL^-1。

试剂体积比对Sevag法脱蛋白效果的影响：取浓度为10 mg·mL^-1粗多糖溶液8份，每份25 mL，分别加入1倍、1/2倍、1/3倍、1/4倍、1/5倍的氯仿-正丁醇（4 ∶ 1，v/v）混合试剂，剧烈振摇30 min，分出氯仿层，将水层和交界处的变性蛋白混悬液离心（999×g）20 min，上清液水浴浓缩至小体积后以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶中，测定多糖含量及蛋白质含量。结果见图1-C，随着试剂量的增加，多糖损失率显著增加，但蛋白脱除率变化不明显。1/2倍时，蛋白脱除率相对较好，多糖损失率也相对较低。

萃取次数对Sevag法脱蛋白效果的影响：取浓度为10 mg·mL^-1粗多糖溶液8份，25 mL/份，加1/2体积的氯仿-正丁醇（4 ∶ 1，v/v）混合试剂，剧烈振摇30min，分出氯仿层，将水层和交界处的变性蛋白混悬液离心（999×g）20 min，上清液再以等体积氯仿-正丁醇（4 ∶ 1，v/v）混合试剂重复萃取，8份样品液萃取次数分别为1，2，3，4，5，6，7，8次，上清液均水浴浓缩至小体积后以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶中，测定多糖含量及蛋白质含量。结果见图1-D，随萃取次数增加，蛋白脱除率明显增加，但多糖损失率也增加。相比较，萃取第3次及以后蛋白脱除率的变化趋势趋于平缓，确定萃取次数为2次。

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  图1 脱蛋白方法的筛选及Sevag法脱蛋白条件的筛选

  Figure 1.Screening of deproteinization method and screening of deproteinization conditions by Sevag method

  注：A. 脱蛋白方法比较；B. 粗多糖原液浓度的影响；C. 试剂体积比的影响；D. 萃取次数的影响

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2.4.7 Sevag法脱蛋白验证试验

取10 mg·mL^-1的粗多糖溶液25 mL共5份，加1/2倍体积的氯仿-正丁醇（4 ∶ 1，v/v）混合试剂，萃取2次，经透析，冷冻干燥，得到纯化后的红芪多糖干燥粉末，采用苯酚-硫酸法测得多糖含量为6.237 mg·mL^-1，多糖的含量由原来的59.38%提高到62.37%，纯度得到一定程度提升。表1中结果显示，平均蛋白脱除率为32.483%，RSD值为4.489%，表明该方法重现性良好。

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  表格1 Sevage法脱蛋白的验证性试验（n=5）

  Table 1.Confirmatory test of deproteinization by Sevage method (n=5)

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2.5 大孔树脂富集纯化红芪多糖的工艺参数优选

2.5.1 树脂的预处理及树脂型号的筛选

4种型号大孔吸附树脂（AB-8、D-101、NKA-9、X-5）以95%乙醇浸泡24 h使充分溶胀，再以95%乙醇反复冲洗，至流出液加蒸馏水无浑浊，再以蒸馏水洗至无醇味[13-17]。

精密称取预处理树脂各3份，每份2.0 g，置50 mL具塞三角瓶；分别加已知浓度的HPS溶液25 mL（苯酚-硫酸法测定多糖含量为1.02 mg·mL^-1），室温下静态吸附8 h，滤过，水浴蒸干，残留物以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶，按苯酚-硫酸法测定，计算含量。上述滤出的树脂，加20％乙醇50 mL，室温静态解吸24 h，滤过，以少量20％乙醇冲洗，洗液并入滤液，水浴蒸干，残留物用蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶，按苯酚-硫酸法测定，计算含量。按下式计算：

比吸附量（mg·g^-1）=（C₀-C_e）×V/m；比解吸量（mg·g^-1）=C₁V/m；解吸率（％）=比解吸量/比吸附量×100％。式中，C₀为起始浓度，C_e为平衡浓度，V为溶液体积，m为树脂质量，C₁为解吸液浓度。

为进一步提高纯度，选择采用大孔吸附树脂进行纯化处理，考察了4种型号树脂（AB-8、D-101、NKA-9、X-5）对红芪多糖的吸附量和吸附率，并对筛选出的树脂相关工艺参数进行优化。综合比较4种大孔树脂的吸附率和解吸率，图2-A显示对红芪多糖的比吸附量为AB-8＞NKA-9＞D-101＞X-5；图2-B解吸率为X-5＞AB-8＞D-101＞NKA-9。虽然X-5解吸率较好，但对红芪多糖的吸附效果不佳，相比较AB-8和D-101型树脂对红芪多糖的吸附解吸性能均较好，AB-8效果更突出些，因此选择使用AB-8型大孔树脂，比吸附量为8.37 mg·g^-1、吸附率为66.99%，比解吸量为7.01 mg·g^-1，解吸率为83.72%。

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  图2 树脂型号对红芪多糖富集的影响

  Figure 2.Effect of resin type on polysaccharide enrichment of Radix Hedysari

  注：A. 对比多糖吸附量/比解吸量的影响；B. 对吸附率/解吸率的影响

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2.5.2 解吸剂的考察

精密称取预处理的AB-8大孔树脂2 g于锥形瓶，加粗多糖溶液25 mL，室温静态吸附8 h，滤过，滤出树脂，分别以50 mL的60%，50%，40%，30%，20%，10%乙醇溶液和水作解吸剂，静态解吸8 h，滤过，以少量相应解吸剂冲洗树脂，洗液并入滤液，水浴蒸干，残留物用蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶，按苯酚-硫酸法测定，计算含量及解吸率。图3-A结果显示：10%~30%的乙醇溶液解吸效果较好，解吸率均达80%以上。考虑到尽量减少水溶性杂质的混入，故确定采用30%乙醇作为解吸剂。

2.5.3 药液质量浓度对红芪多糖富集影响的考察

精密称取预处理的AB-8树脂8份，各2 g/份，分别加入质量浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg·mL^-1的多糖溶液25 mL，静态吸附8 h，滤过，水浴蒸干，残渣以蒸馏水溶解定容至25 mL量瓶，按苯酚-硫酸法测定，并计算含量及比吸附量（mg·g^-1）。图3-B结果表明，上样液质量浓度为1.5 mg·mL^-1和2.0 mg·mL^-1时，比吸附量较好，之后随着上样液质量浓度的增加比吸附量变化不明显，说明此时树脂吸附性能已被充分利用，而上样液过于黏稠，会影响树脂性能，因此选择1.5 mg·mL^-1。

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  图3 不同工艺参数优选

  Figure 3.Figure 3. Different preferable proces parameters

  注：A. 解吸剂浓度的影响；B. 药液质量浓度对富集的影响；C. AB-8型大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线；D. 动态吸附上样液流速考察；E. 动态解吸洗脱液流速考察

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2.5.4 静态吸附动力学曲线的制备

精密称取预处理的AB-8树脂5 g，加红芪多糖液50 mL，室温振荡24 h进行吸附，分别在1，2，4，6，8，10，12，24 h时吸取上清液2.0 mL，水浴蒸干，残渣以蒸馏水溶解定容至10 mL，按苯酚-硫酸法测定吸光度，计算含量及比吸附量。以比吸附量（mg·g^-1）对时间t（h）作图，得静态吸附动力学曲线。由图3-C可知，比吸附量在2~6 h急剧增加，6 h后增加缓慢，8 h后基本平衡，12 h后下降，尤其24 h时比吸附量下降显著，考虑可能是浸泡时间过长，导致已吸附的多糖产生复解吸，选择静态吸附时间为8 h。

2.5.5 动态吸附上样液流速的考察

取预处理的AB-8树脂25 g，湿法装柱（2 cm×50 cm）。取多糖液250 mL，分别以0.5，1.0，2.0，3.0 mL·min^-1的流速上样，进行动态吸附，流出液循环吸附2次；收集吸附后的流出液，水浴蒸干，残渣以蒸馏水溶解定容至250 mL，按苯酚-硫酸法测定，计算含量及吸附率。图3-D结果显示，上样液流速在2.0 mL·min^-1以下时，吸附效果均可达到60%以上，结合静态吸附试验，确定吸附过程为：室温下，上样液以2.0 mL·min^-1以下流速循环上样，动态吸附2次，后静态吸附，动态吸附和静态吸附累计时间不小于8 h。

2.5.6 动态解吸洗脱液流速的考察

取预处理的AB-8树脂25 g，湿法装柱（2 cm×50 cm）。取多糖液250 mL，以上述方式吸附，后以总体积200 mL的30%乙醇分别以0.5，1.0，2.0，3.0 mL·min^-1流速动态解吸，洗脱液水浴蒸干，以蒸馏水溶解定容至250 mL，按苯酚-硫酸法测定，计算含量及解吸率。图3-E结果显示，洗脱液流速在1.0 mL·min^-1以下时，解吸效果较好。

2.5.7 AB-8大孔吸附树脂纯化工艺的验证试验

取预处理的AB-8大孔树脂25 g湿法装柱（2 cm×50 cm），取250 mL多糖样品溶液，以2.0 mL·min^-1流速循环上样2次，动态吸附后再静态吸附6~8 h。后以30%乙醇1.0 mL·min^-1进行洗脱，洗脱液用量600 mL，收集洗脱液并浓缩蒸干，残渣以蒸馏水溶解定容至250 mL，按苯酚-硫酸法测定，计算含量，结果见表2。AB-8大孔树脂纯化后，所得样品中多糖含量由62.37%提高到78.97%，纯度提高了1.27倍，回收率为69.30%。纯化后的红芪多糖为类白色，质地细腻。

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  表格2 AB-8大孔树脂纯化红芪多糖的验证试验

  Table 2.Validation experiment of purification of Hedysarum Polysaccharide by AB-8 macroporous resin

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2.6 纯化处理前后多糖样品的光谱比较分析

2.6.1 紫外光谱分析

将纯化前后的多糖溶液均稀释10倍，用紫外分光光度计于200~800 nm进行光谱扫描。结果见图4。以Sevag法脱蛋白，并经AB-8大孔树脂纯化处理后的多糖样品水溶液在280 nm波长处没有吸收峰，核酸和蛋白被清除，可见纯化效果较明显。

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  图4 纯化后红芪多糖紫外光谱

  Figure 4.UV spectrum of purified Radix Hedysari polysaccharide

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2.6.2 傅里叶红外光谱分析

取纯化前后的HPS样品粉末1.50 mg，与200 mg色谱纯溴化钾充分混合，用玛瑙研钵研磨。以红外分光光度计在4 000~500 cm^-1区扫描，共扫描64次，分辨率2 cm^-1。以纯溴化钾的红外光谱图作为背景。红外结果见图5。多糖的特征吸收峰3 392.1 cm^-1附近的宽吸收峰是由-OH的伸缩振动引起的；2 923.4 cm^-1和1 427.6 cm^-1处的吸收峰是由C-H 键伸缩振动引起的；1 664.4 cm^-1左右的吸收峰是由羧基的C=O对称伸缩振动所引起的；1 054.1 cm^-1左右的强吸收峰是糖苷键C-O-C的非对称振动峰，为吡喃糖的特征吸收峰；通过对比脱蛋白前后HPS的红外光谱，可知经大孔树脂脱蛋白后，1 5483 cm^-1宽吸收峰（蛋白质分子中 N- H 变角振动）消失，证明蛋白质被成功清除。同时，因消除了蛋白质对多糖特征吸收峰强度的干扰，3 392.1 cm^-1和1 664.4 cm^-1两处的吸收峰强度有所加强，并且纯化后多糖结构特征的指纹区吸收峰表现的更加显著[18]。

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  图5 脱蛋白前、后HPS的IR光谱

  Figure 5.IR spectra of HPS before and after deproteinization

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3 讨论

中药标准提取物是在体现中医临床用药整体观、系统论和辨证论治的优势和特色基础上提出的，在疾病预防及保健品开发方面有广阔的应用前景[19]。本研究以HPS标准提取物为目标，根据多糖的理化性质，采用脱蛋白、大孔树脂等技术方法对红芪多糖进行纯化富集，对关键参数进行筛选确定，所得样品多糖含量由原来62.37%提高到78.97%，纯度提高了1.27倍；并对多糖样品进行了光谱比较。结果显示，经纯化处理后的多糖UV光谱在280 nm波长处没有蛋白质吸收峰；且纯化后样品的IR光谱表现出更为突出的多糖结构特征吸收峰。结果表明，优选出的HPS脱蛋白和大孔树脂纯化工艺稳定可行，重复性较好，使多糖得到较好的富集，为HPS标准提取物的形成以及其能成为制剂科学化原料药提供了研究基础。

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