目的  建立不同产地侧柏叶的HPLC指纹图谱，并采用化学模式识别评价侧柏叶质量。

方法  采用HPLC法。以ZORBAX Eclipse plus-C₁₈为色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1% 磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速：1.0 mL·min^-1，检测波长：254 nm。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）建立24批侧柏叶HPLC指纹图谱并进行相似度评价，结合混合对照品图谱确定共有峰。采用SPSS 25.0软件进行聚类分析。采用Simca-P软件进行主成分分析和偏最小二乘法-判别分析，并筛选影响侧柏叶质量的差异性成分。

结果  侧柏叶指纹图谱中共有13个共有峰，与对照指纹图谱相比，除S2一批外，其余23批药材的相似度均高于0.92。并指认了杨梅苷、槲皮苷、异槲皮苷、穗花双黄酮4个共有峰。聚类分析结果显示24批药材聚为两类，S1、S3-S24聚为一类，同一产地的药材有较大差异，不同产地药材也有相似性；S2聚为一类为圆柏叶。主成分分析结果表明6类主成分的累计方差贡献率为88.412%，可以反映原始色谱峰大部分信息。偏最小二乘法判别分析筛选出5种成分，是24批药材产生质量差异的标志性成分。

结论  所建HPLC指纹图谱方法操作简便、准确，结合化学模式识别可用于侧柏叶的质量控制。峰8等5个成分为影响侧柏叶质量的差异性成分。

侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和叶，其气清香，味苦涩，归肺、肝、脾经，具有凉血止血、化痰止咳、生发乌发的功效。主要用于治疗吐血、咯血、便血、崩漏下血、肺热咳嗽、血热脱发、须发早白[1]。侧柏叶中含有多类药用活性成分，主要是黄酮类、挥发油、鞣质类等，具有抗炎、抗菌、止血、镇咳祛痰、抗氧化、生发乌发等的药理作用[2-6]。姚慧娟等[7]采用气相色谱-质谱法（GC-MS）对侧柏叶中挥发性成分进行分析研究，分离出20种挥发性成分，鉴定出15种化合物；石典花等[8]采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术（UPLC-QTOF-MS/MS）对侧柏叶炒炭前后化学成分进行辨识和比较，结果发现黄酮类成分为侧柏叶炒炭前后功效变化的主要原因；王树宁等[9-10]采用响应面法优化超声辅助提取研究了侧柏叶中总黄酮的提取工艺，结果发现超声提取能充分提取侧柏叶中黄酮类成分。上述研究显示，侧柏叶具有诱人的前景，可以应用于医药、农药、化妆品等领域。

侧柏叶作为传统中药材其含有复杂的化学成分，采用单一化学成分很难准确地评价其质量。中药指纹图谱具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性的特点，能较为全面地反映中药中化学成分信息，已被广泛用于中药材及中药复方的质量控制和评估领域，采用中药指纹图谱的研究改进侧柏叶的质量标准，为其药材和饮片的质量控制提供有效方法，保障了其在临床上的应用。查阅文献发现有关侧柏叶指纹图谱的研究报道比较少，本文主要建立了侧柏叶的指纹图谱并结合指纹图谱相似度分析、聚类分析以及主成分分析，分析了不同产地侧柏叶之间的差异，为充分发挥其药用价值，同时为中药材侧柏叶的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；ME24-102/XS205Du型电子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.2 试药

杨梅苷（中国食品药品检定研究院，批号：111860-201001，含量以92.3 %计算）；异槲皮苷（中国食品药品检定研究院，批号：111809-201403，含量以92.9%计算）；槲皮苷（中国食品药品检定研究院，批号：111538-200504）；穗花双黄酮（上海源叶生物科技有限公司，批号：PA0819RB13，含量以98.0%计算）；水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

24批药材采集自不同产地，经兰州大学蒲训教授鉴定S2为圆柏Sabina chinensis（L.）Ant的干燥枝梢和叶，其余23批为侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和叶。药材信息见表1。

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  表格1 24批侧柏药材样品来源信息

  Table 1.Sample information of 24 batches of Platycladus orientalis

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2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱程序见表2；检测波长：254 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL·min^-1；进样量：10 μL。

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  表格2 梯度洗脱程序

  Table 2.Gradient elution programme

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2.1.2 混合对照品溶液的制备

精密称取杨梅苷对照品10.39 mg、异槲皮苷对照品11.04 mg、槲皮苷对照品10.26 mg、穗花双黄酮对照品11.82 mg，分别置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得各单一对照品贮备液。分别精密吸取上述各单一对照品贮备液适量，加甲醇稀释，制成杨梅苷、异槲皮苷、槲皮苷、穗花双黄酮质量浓度分别为33.25，4.12，98.50，7.57 µg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取24批样品，粉碎，取粉末（过四号筛），精密称取0.3 g，加入30 mL 70% 甲醇，超声处理（功率：700 W，频率：80 kHz）30 min，过滤，收集滤液，蒸干，加70%甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.4 精密度试验

取样品粉末（编号： S21）按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定 6次，以槲皮苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示13个共有峰相对保留时间RSD均小于0.86%（n=6）和相对峰面积RSD均小于2.61%（n=6）。表明方法精密度良好。

2.1.5 重复性试验

取样品粉末6份（编号：S21），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以槲皮苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示13个共有峰相对保留时间的RSD均小于2.62%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.81%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验

取样品粉末（编号：S21）按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以槲皮苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示13个共有峰相对保留时间的RSD均小于1.85%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.01%（n=6）。表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定良好。

2.1.7 指纹图谱的建立

分别取24批药材粉末，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将24批样品的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行分析，设置S9为参照指纹图谱，采用中位数法，时间宽度为0.2 min，多点校正自动匹配，系统生成24批样品的叠加指纹图谱和对照指纹图谱。结果显示，24批样品共有13个共有峰。详见图1和图2。

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  图1 24批侧柏叶药材的HPLC叠加指纹图谱

  Figure 1.HPLC superimposed fingerprint of 24 batches of Platycladus orientalis

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  图2 侧柏叶对照指纹图谱

  Figure 2.Reference fingerprint of Platycladus orientalis

  注：4. 杨梅苷；5. 异槲皮苷；6. 槲皮苷；9. 穗花双黄酮

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2.1.8 共有峰的指认

经与混合对照品色谱图（取“2.1.2”项下混合对照品溶液同法测定所得，见图3）比对，共指认了4个共有峰，分别为杨梅苷（峰4）、异槲皮苷（峰5）、槲皮苷（峰6）、穗花双黄酮（峰9）。选择中国药典2020年版规定的槲皮苷为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD为28%~250%，差异较大，说明不同产地的侧柏叶中成分具有较高的相似度，但含量差异较大。

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  图3 混合对照品色谱图

  Figure 3.Mixed reference chromatograms

  注：1. 杨梅苷；2. 异槲皮苷；3. 槲皮苷；4. 穗花双黄酮

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2.1.9 相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对24批样品相似度评价。结果显示，与对照指纹图谱（R）相比，23批（编号：S1，S3-S24）样品的相似度大于0.92，1批（编号：S2）次相似度为0.486。表明不同产地侧柏叶的色谱特征相似，其化学成分组成大致相同、质量稳定、差异较小。结果见表3。

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  表格3 24批侧柏叶的相似度评价结果

  Table 3.Similarity evaluation results of 24 batches of Platycladus orientalis

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2.2 聚类分析

采用SPSS 25.0 软件，将共有峰的峰面积相对标准化处理后，进行聚类分析，结果见图4。当类间距为10时，分为3类，I类为S4、S6-S14、S16-S24，主要产区为河南、海南、山西、安徽、湖北、重庆、河北、湖南；Ⅱ类为S1、S3、S5、S15，主要产区为河南、山西；两类产地有交叉；Ⅲ类为S2，来自湖南。当类间距为20时，样品可分为2类，S1、S3-S24为第一类，该23批为侧柏叶；S2为第二类，该药材为圆柏叶，有别于其余23批药材。聚类结果表明同一产地的药材有较大差异，不同产地药材也有相似性，同时可以区分侧柏叶与圆柏叶，这为侧柏叶与圆柏叶的区分提供技术支撑。

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  图4 24批侧柏叶聚类分析树状图

  Figure 4.Dendrogram of cluster analysis of 24 batches of Platycladus orientalis

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2.3 主成分分析

将24批样品根据产地分为6组，在聚类分析的基础上，利用SPSS 25.0软件进行主成分分析。特征值及提取载荷平方和见表4，载荷矩阵见表5。从表4可知提取的6类主成分的累计方差贡献率为88.412%，从表5可知，第一类主成分为色谱峰4、5、6和7，第二类主成分为色谱峰3、8和9，第三类主成分为色谱峰10和13，第四类主成分为色谱峰9和11，第五类主成分为色谱峰12，第六类主成分为色谱峰3，表明样品指纹图谱中绝大部分的化学信息可通过该6类主成分反映出来；也是引起不同产地不同批次侧柏叶的差异性的主要原因。

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  表格4 主成分分析特征值及提取载荷平方和

  Table 4.Principal component eigenvalue and variance contribution rate

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  表格5 主成分分析载荷矩阵

  Table 5.Principal component analysis load matrix

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采用Simca-P 14.1软件对侧柏叶进行主成分分析，绘制主成分得分图。由图5可知，除了海南的侧柏叶，其他不同产地的侧柏叶基本上比较聚集，说明海拔、温湿度对侧柏叶的质量有一定的影响；同时由图5可知，S2与其他23批样品未聚为一类，说明该方法可以有效的区别侧柏叶与圆柏叶，结果验证了聚类分析的结果。得分图见图5。

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  图5 24批侧柏叶主成分得分图

  Figure 5.PLS-DA scoring plot of 24 batches of Platycladus orientalis

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2.4 偏最小二乘法-判别分析

建立24批样品等级分类与标定的13个成分的多元线性关系，将数据导入Simca-P 14.1软件，进行偏最小二乘法-判别分析回归分析。模型R2X(cum)=1、Q2(cum)=0.996，得到13个化合物的贡献情况依次为P8＞P6＞P9＞P3＞P4＞P5＞P10＞P11＞P13＞P12＞P1＞P7＞P2。结果见图6。以贡献值＞1为标准得到5个成分，其中有3个峰已指认，分别为6-槲皮苷、9-穗花双黄酮、4-杨梅苷。说明这5个成分是影响侧柏叶质量的主要标志性成分。

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  图6 24批侧柏叶样品中13个共有峰的变量重复性投影得分图

  Figure 6.VIP values of 13 common peaks in 24 batches of Platycladus orientalis

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3 讨论

3.1 提取工艺及色谱条件考察

本试验通过考察并查阅相关文献，采用不同浓度的甲醇溶液对侧柏叶中化学成分的提取进行比较，结果发现采用70%甲醇时，指纹图谱中的化学成分较多。关于有机流动相的选择，经查阅文献[11-13]，采用乙腈比采用甲醇的分离效果好，各个成分的峰型没有拖尾现象，因此，流动相的有机相选择乙腈。在190~800 nm进行全波长扫描，结果在254 nm时色谱峰较多，分离度较好，故选择波长为254 nm。超声提取[14-16]对黄酮类成分的提取较回流提取理想，故选择采用超声提取的方式。

3.2 化学计量学分析

对24批药材进行相似度分析，结果除了S2药材外，23批药材相似度均大于0.92，相似度良好，表明建立的指纹图谱方法可靠。对共有的13种化学成分进行聚类分析、主成分分析和偏最小二乘法-判别分析，结果表明单一的化学成分不能完全评价侧柏叶的质量，同时评价侧柏叶的质量不能单考虑化学成分含量高的。建立的中药指纹图谱可以全面地评价侧柏叶的质量。

综上，本试验建立了侧柏叶的指纹图谱，并结合中药指纹图谱相似度分析和聚类分析、主成分分析及最小二乘法-判别分析，全面研究了不同产地侧柏叶之间的差异，为侧柏叶的质量控制提供参考。

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