目的  基于指纹图谱和网络药理学研究方法，建立三七参蜂口服液的指纹图谱并预测分析质量标志物。

方法  采用HPLC法建立12批三七参蜂口服液的指纹图谱，并对色谱峰进行指认和归属，结合中药色谱指纹图谱相似度评价、聚类分析、主成分分析及偏最小二乘法判别（OPLS-DA）等多元统计分析方法筛选出候选成分；通过网络药理学构建三七参蜂口服液“成分-靶点-通路”的网络，预测其质量标志物。

结果  建立的 HPLC指纹图谱确定13个共有峰，与参照物比对指认3（二苯乙烯苷）、5（苯甲酸钠）、6（党参炔苷）、7（三七皂苷R1）、9（人参皂苷Rg1）、10（人参皂苷Re）、12（10-羟基-2癸烯酸）、13（人参皂苷Rb1）8个共有色谱峰；12批三七参蜂口服液样品相似度均在0.997以上，聚类为2类，OPLS-DA分析得出2、3、4、7、9、10、11、12号色谱峰是影响三七参蜂口服液质量的主要标志性成分。网络药理学预测党参炔苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Re、10-羟基-2癸烯酸为三七参蜂口服液潜在的质量标志物，通过信号转导及转录激活蛋白3-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1-动力相关蛋白1信号通路、缺氧诱导因子1信号通路和磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号通路等发挥传统功效。

结论  所建立的指纹图谱重复性好，稳定可行；6个标志性成分对三七参蜂口服液质量影响较大、具有传递性和追溯性，且与功效密切相关，可作为潜在质量标志物为三七参蜂口服液质量控制与评价提供科学基础。

三七参蜂口服液是由三七、党参、蜂王浆、枸杞、何首乌5个药味制备而成的中药制剂，其质量标准为国家药品标准WS-5834(B-0834)-2014Z，具有补中益气、养血生津、滋补肝肾的功效，用于病后及老年体虚属气血不足、肝肾亏损证，症见头昏耳鸣、头痛失眠、食欲不振、神疲乏力等[1]。中药质量是对中药有效性和安全性的反映和表征，是中成药有效性控制的重要依据。2016年刘昌孝院士[2]基于中药质量控制指标与中药有效性的关联性、专属性差的现状，提出了中药质量标志物（Q-marker）的概念，阐述中药由于化学成分复杂导致物质-功效之间呈现多元、非线性关系，其质量评价不但需要以某些成分的含量作为指标，还需要对中药整体的“化学轮廓”及其相应的“生物学模式”进行关联性研究。指纹图谱技术是常用的基于“化学轮廓”模式识别方法，可有效地表达中药制剂中各药味的存在，全面反映中药制剂的质量信息，结合聚类分析与主成分分析技术可对指纹图谱所呈现的质量信息进行初步分析，更加系统、全面地评价中药材的质量[3- 4]。网络药理学作为谱-效相关分析方法的一种，可分析提炼成分-靶点-通路-功效的关联进而探索成分与药效的关联关系，为建立中药活性指纹图谱提供了研究手段[5]。本研究采用相似度评价和主成分分析（principal component analysis，PCA）等方法分析三七参蜂口服液的指纹图谱，探索影响其质量控制的成分，并与网络药理学相结合，预测发挥药效的潜在成分，分析质量控制指标是否合理，以期建立三七参蜂口服液的活性指纹图谱，为从整体的化学轮廓角度评价其质量提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（配备四元梯度泵G1311C、自动进样器G1329B、柱温箱G1316A、紫外检测器G1315D），美国Agilent公司；XSE 205型电子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q POD超纯水仪，德国Merck公司；N-1100D-W型旋转蒸发仪，东京理化有限公司。

1.2 试剂与材料

三七皂苷R₁对照品（批号：110745-201921，含量以90.4%计）、人参皂苷Rg₁对照品（批号：110703-202034，含量以94.0%计）、人参皂苷Rb₁对照品（批号：110704-202129，含量以94.3%计）、人参皂苷Re对照品（批号：110754-202129，含量以96.0%计）、党参炔苷对照品（批号：111732-201607，鉴别用）、二苯乙烯苷对照品（批号：110844-202116，含量以94.8%计）、10-羟基-2-癸烯酸对照品（批号：110812-201808，含量以97.5%计）均购自中国食品药品检定研究院；苯甲酸钠（批号：F2012004）、蜂蜜（批号：Y2201001）、三七参蜂口服液样品及处方饮片均由云南白药集团有限公司提供，样品编号及批号见表1。

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  表格1 三七参蜂口服液样品和处方饮片的批号信息

  Table 1.Sample information of Sanqi Shenfeng oral liquid and herbal medicines pieces

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2 方法与结果

2.1 色谱条件

以Waters Symmetry C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 µm）为色谱柱；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0~60 min，5%~25%乙腈；60~85 min，25%~70%乙腈；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：203 nm；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液制备

分别取人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、三七皂苷R₁、人参皂苷Re、二苯乙烯苷、10-羟基-2-癸烯酸、党参炔苷对照品及苯甲酸钠各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释，制成每1 mL中含各对照品约0.1 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备

精密量取三七参蜂口服液样品10 mL，用水饱和正丁醇液振摇提取3次，每次10 mL，合并水饱和正丁醇液，减压回收至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取三七参蜂口服液（编号：S1）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以12号峰10-羟基-2-癸烯酸为参照峰，计算各色谱峰相对保留时间RSD＜2.0%，相对峰面积RSD ＜3.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取三七参蜂口服液样品（编号：S1），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以12号峰10-羟基-2-癸烯酸为参照峰，计算各色谱峰相对保留时间RSD＜1.0%，相对峰面积RSD＜3.0%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取三七参蜂口服液（编号：S1）供试品溶液，分别于0、3.5、7.5、18、40、75 h按“2.1”项下色谱条件测定，以12号峰10-羟基-2-癸烯酸为参照峰，计算各色谱峰相对保留时间RSD ＜1.0%，相对峰面积RSD均＜3.0%（n=6），表明供试品溶液在75 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立与相似度评价

取12批三七参蜂口服液供试品溶液按“2.1”项下色谱条件测定，记录指纹图谱。运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件进行分析，以S1为参照图谱，以中位数法生成三七参蜂口服液指纹图谱共有模式，结果见图1。以共有模式为对照图谱，计算12批样品的指纹图谱相似度。结果（表2）显示12批样品指纹图谱的相似度均大于0.95，表明建立的指纹图谱可稳定的表征三七参蜂口服液指纹特征。

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  图1 12批次三七参蜂口服液样品HPLC指纹图谱（A）、混合对照品图谱（B）及对照指纹图谱（C）

  Figure 1.HPLC fingerprint of 12 batches of Sanqi Shenfeng oral liquid samples (A)，HPLC diagram of mixed control (B)and control fingerprint (C)

  注：3. 二苯乙烯苷；5. 苯甲酸钠；6. 党参炔苷；7. 三七皂苷R1；9. 人参皂苷Rg1；10. 人参皂苷Re；12. 10-羟基-2癸烯酸；13. 人参皂苷Rb1。

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  表格2 12批三七参蜂口服液样品相似度评价

  Table 2.Similarity evaluation of 12 batches of Sanqi Shenfeng oral liquid samples

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2.6 共有峰归属

通过比对参照物溶液、三七参蜂口服液、阴性样品及药味供试品溶液的色谱峰保留时间及紫外吸收谱，对13个共有峰进行归属，见图2。结果显示：2号峰来自蜂蜜，3号峰（二苯乙烯苷）、4号峰来自何首乌，5号峰为辅料苯甲酸钠，6号峰（党参炔苷）来自党参，7号峰（三七皂苷R₁）、9号峰（人参皂苷Rg₁）、10号峰（人参皂苷Re）、13号峰（人参皂苷Rb₁）来自三七，8号峰、11号峰、12号峰（10-羟基-2癸烯酸）来自蜂王浆，枸杞的色谱峰未在指纹图谱中体现。

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  图2 三七参蜂口服液样品物质基准特征峰归属

  Figure 2.Attribution of reference characteristic peaks of Sanqi Shenfeng oral liquid samples

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2.7 聚类分析和主成分分析

将12批次三七参蜂口服液指纹图谱的13个共有峰峰面积数据导入SPSS 26.0软件，采用组间联接聚类方法，测量区间选择欧式距离开展聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA），结果见图3。当欧式距离为20时，12批次三七参蜂口服液聚类为2类，S6~S9号样品聚为一类，S1~S5、S10~S12号样品聚为一类。基于相关性进行PCA，主成分特征值及方差贡献率分析见表3，以特征值＞1为标准，提取得到4个主成分，其方差累积贡献率为88.276%＞80%，可解释总方差的88.276%的信息，具有很好的代表性，可用以评价三七参蜂口服液的质量。

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  图3 12批三七参蜂口服液样品聚类分析结果

  Figure 3.Cluster analysis results of 12 batches of Sanqi Shenfeng oral liquid samples

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  表格3 特征值和方差贡献率

  Table 3.Characteristic value and variance contribution rates

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2.8 偏最小二乘法判别分析

将12批次三七参蜂口服液的13个共有峰峰面积数据导入SIMCAP 14.1软件进行偏最小二乘法判别（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）分析[6]，PCA分析得分见图 4A，12批样品分为2类，与HCA和PCA分析结果一致。OPLS-DA分析中自变量拟合指数（R²x）为0.868，因变量拟合指数（R²y）为0.994，模型预测指数（Q²）为0.911，R²和Q²超过0.5表示模型拟合结果可接受[7]，OPLS-DA得分图见图 4B。通过变量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）值筛选出影响三七参蜂口服液样品分类的标志性成分，结果见图4C，以VIP＞1为筛选标准，确定2、3（二苯乙烯苷）、4、7（三七皂苷R₁）、9（人参皂苷Rg₁）、10（人参皂苷Re）、11、12（10-羟基-2癸烯酸）号色谱峰是影响三七参蜂口服液样品成分差异的主要标志性成分。

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  图4 12批三七参蜂口服液样品PCA得分图（A）、OPLS-DA得分图（B）及VIP图（C）

  Figure 4.PCA score plot (A), OPLS-DA score plot (B) and VIP value (C) of 12 batches of Sanqi Shenfeng oral liquid samples

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2.9 网络药理学分析

2.9.1 候选化合物靶点预测

基于共有峰归属和OPLS-DA分析，二苯乙烯苷（HSW）、党参炔苷（DS1）、三七皂苷R₁（SQ1）、人参皂苷Rg₁（SQ2）、人参皂苷Rb₁（SQ3）、人参皂苷Re（SQ4）、10-羟基-2癸烯酸（FWJ1）共7个化学成分能够实现饮片到制剂的传递，且为影响三七参蜂口服液质量的主要标志性成分，作为候选化合物进行靶点预测。采用PubChem查找7个候选化合物的规范的简化分子线性输入规范（canonical simplified molecular input line entry specification，canonical SMILES），分别输入Swiss Target Prediction 数据库（https://david.ncifcrf.gov）开展对应靶蛋白的预测，除去重复值，得到75个相关靶点。将化合物与靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，构建饮片-化合物-靶点网络图，见图5[7-10]。其中化合物10-羟基-2-癸烯酸（FWJ1）、三七皂苷R₁（SQ1）、人参皂苷Rg₁（SQ2）的度值分别为30、24、12，表明这3个化合物对应的靶点较多，影响较大。

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  图5 饮片-成分-靶点图

  Figure 5.Drug-component-target network

  注：正方形节点代表药味，八边形节点为化学成分，菱形节点代表靶点。

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2.9.2 蛋白质相互作用网络构建

将预测得到的75个靶点导入STRING（https://cn.string-db.org/）数据库进行蛋白质相互作用（protein-protein interaction network，PPI）网络的构建，限定物种为“人”，蛋白交互评分值＞0.9，结果导入Cytoscape 3.9.1软件中构建PPI网络[8-11]，见图6。对分析结果进行拓扑属性分析，选取度值（degree）、介数中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3 个拓扑参数均大于中位数且度值≥10的靶点作为关键靶点，获得8个关键靶点，见表4。

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  图6 经可视化分析的PPI网络图（A）、原始PPI网络图（B）

  Figure 6.The PPI network analyzed by visualization (A), original PPI network (B)

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  表格4 靶点网络的拓扑学性质

  Table 4.Topological properties of target network

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2.9.3 基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析

采用David数据库（https://david.ncifcrf.gov）对8个关键靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析，包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cell composition，CC）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以P＜0.05和伪发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05对GO分析获得条目进行筛选，共得到26个条目，其中BP占21条，MF占4条，CC占1条，见图 7。BP主要包括蛋白质磷酸化的正向调节、基因表达的正向调控、肽基丝氨酸磷酸化的正向调节、细胞增殖正向调节、磷酸化的正向调节、内皮细胞迁移的正向调节等，MF主要涉及相同蛋白结合、氧化氮合酶活性调节、酶结合、蛋白同二聚化活性，CC为大分子复合物。KEGG分析共获得68条通路，以P＜0.01筛选得到43条通路，其中排名前20 名的通路见图8，三七参蜂口服液中7个候选化合物富集的通路主要包括癌症、病毒感染、能量代谢、雌激素等信号通路，结果见表5。

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  图7 GO富集分析结果

  Figure 7.GO enrichment analysis result

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2.9.4 成分-靶点-通路构建

将7个候选化合物、8个关键靶点、43条通路导入Cytoscape 3.9.1软件中构建成分-靶点-通路网络图，见图9。以化合物、靶点蛋白、信号通路的连接度为参考，化合物中人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁和三七皂苷R₁的连接度较高，可能是三七参蜂口服液发挥药效的主要化学物质，靶点蛋白中血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源蛋白（KRAS）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、信号转导和转录激活因子-3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的连接度较高，其中STAT3与人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁和三七皂苷R₁均有连接，可能是三七参蜂口服液的主要关键靶点，43条信号通路的连接度差异不大，均可能是三七参蜂口服液的关键信号通路。

3 讨论

3.1 质量标志物分析

三七参蜂口服液由三七、党参、蜂王浆、枸杞、何首乌5个药味制备而成，其功效为补中益气、养血生津、滋补肝肾。《本草纲目拾遗》中论述三七的功效为人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药之最珍贵者。三七与人参同为五加科人参属植物，人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁和三七皂苷R₁等皂苷类物质是该属植物最主要的次生代谢产物，是人参属“特有性”成分，也是发挥扩张血管、抑制血小板凝集、抗炎、抗癌、免疫调节等药理活性的物质基础[12- 13]。《本草正义》中论述党参力能补脾养胃、润肺生津、健运中气，与人参不甚相远。党参主要含聚炔、多糖、黄酮类等成分，其中党参炔苷作为其标志性成分，也是发挥抗溃疡、免疫调节、抗癌、抗菌、抗病毒等药理活性的物质基础[14]。蜂王浆广泛用于改善各种慢性健康问题，其主要化学成分10-羟基-2-癸烯酸被称为王浆酸，约占蜂王浆干物质成分的3.5%，被认为是评价蜂王浆质量的重要指标，也是蜂王浆抗菌、抗炎、调节癌症、促进免疫和抵御皮肤损伤等生物学活性的物质基础之一[15]。何首乌始载于《开宝本草》，炮制后具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨的功效，现代药理学研究[16]表明，二苯乙烯苷具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用与传统药效补肝肾和益精血相对应,是何首乌的主要药效物质基础之一。枸杞始载于《神农本草经》，具有滋补肝肾、养阴润肺等功效，其富含糖类、生物碱类、黄酮类及酚酸类成分，具有调节免疫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用，其中枸杞多糖与枸杞子的传统功效相对应，是枸杞子传统功效的主要物质基础[17]，而甜菜碱亦是枸杞中重要的化合物，在我国药典中用于枸杞药材及其制剂的质量控制，可为机体提供甲基和维持细胞渗透压。

中医学认为“气”是人体内运行不息的极精微物质，是构成和维持人体生命活动的基础物质之一，这与现代医学的能量极为相似，所以中医的“气”与现代生物学的“能量”在理论与概念上具有相通性[18]。三七参蜂口服液具有补中益气之功，从现代药理学角度分析，其可能调控了人体的能量代谢过程，这与本研究网络药理学结果基本一致。从网络药理学分析结果可知，三七参蜂口服液的主要成分可能作用于AKT1、STAT3、VEGFA、EGFR等靶点，通过信号转导及转录激活蛋白3-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1-动力相关蛋白1信号通路（signal transducer and activator of transcription 3-serine/threonine kinase 1-dynamin-related protein 1，STAT3/AKT1-Drp1）、单磷酸腺苷激活的蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号通路（PI3K-Akt signaling pathway，PI3K-AKT）、缺氧诱导因子1信号通路（HIF-1 signaling pathway，HIF-1）对细胞的能量代谢和血液供应起调节作用。

PPI网络分析结果显示，STAT3和AKT1是三七参蜂口服液的两个关键靶点，已有相关研究 [19]证实STAT3和AKT1均可通过促进下游分子Drp1在Ser637位点的磷酸化从而促进线粒体分裂，而线粒体作为细胞制造能量的结构，通过自身“分裂”与“融合”的形态变化在细胞能量调节过程中发挥重要作用。因此结合本研究结果，推测三七参蜂口服液可能通过调控线粒体功能发挥调节机体能量代谢的作用。

KEGG分析结果显示，在排名前20的通路中，除癌症相关通路占比较高外，三七参蜂口服液还主要富集在能量代谢相关通路上，包括HIF-1信号通路和PI3K-AKT信号通路，其中HIF-1为葡萄糖代谢经典通路，而PI3K-AKT信号通路则有研究证明其与葡萄糖代谢、脂质合成和代谢均相关，这与三七参蜂口服液的传统功效是一致的。HIF-1信号通路是人体应答缺氧应激的关键，可调控细胞产生的一系列缺氧代偿反应，一方面，HIF-1介导缺氧条件下的糖酵解路径供能，另一方面，HIF-1的下游PDK蛋白可以抑制乙酰辅酶A的合成，阻断三羧酸循环，降低氧消耗[20]。PI3K-AKT信号通路在机体多器官/组织中调控脂代谢相关基因的表达，并且其参与机体包括脂质的合成、转运、摄取与分解等在内的一系列调控[21]。PI3K-AKT信号通路与葡萄糖代谢途径也密切相关，其介导缺氧环境下细胞的糖酵解途径[22]。

此外，本研究结果显示三七参蜂口服液调控了AMPK激酶，AMPK作为一个重要的蛋白激酶，被称为“细胞能量调节器”，是生物能量代谢调节的关键分子。一方面，AMPK作为磷酸腺苷激活的蛋白激酶/沉默信息调节因子2相关酶1/基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子1α信号通路上的关键分子，在调控线粒体数量和功能方面发挥着不可替代的作用[23-24]；另一方面，AMPK可启动产生三磷酸腺苷的分解代谢途径；再者，AMPK激酶还可通过磷酸化激活内皮型一氧化氮合酶，产生一氧化氮，调节血管张力，舒张血管平滑肌，增加血流，以改善缺血缺氧组织的血氧供应[25]。

综上所述，7个候选化合物为相应饮片的特征性化学成分，可实现从饮片-制剂的传递和追溯，阴性无干扰专属性强，为三七参蜂口服液发挥补中益气，养血生津，滋补肝肾传统功效的主要物质基础，网络药理学预测7个候选化合物中6个化合物可作用于多个靶点，干预不同通路发挥药效作用，说明指纹图谱所选的指标成分具有合理性，故可初步预测党参炔苷、三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Re、10-羟基-2癸烯酸为三七参蜂口服液潜在的质量标志物。

3.2 研究局限性

枸杞多糖和甜菜碱理应是三七参蜂口服液的质量标志物，但建立的三七参蜂口服液指纹图谱中无色谱峰归属于枸杞多糖成分或甜菜碱。分析枸杞多糖未出现色谱峰的原因，一是因为多糖类属大极性成分，在通过十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时难以保留而形成有效分离，会跟随流动相直接流出色谱柱，且多糖中几乎无共轭双键，紫外吸收较弱且为末端吸收，在二极管阵列检测器检测中不具优势。二是三七参蜂口服液供试品制备时采用正丁醇萃取，样品中多糖类成分留于水层被弃去；同时本研究对于甜菜碱未出现色谱峰的原因进行一定探索研究，将指纹图谱采用的C₁₈色谱柱替换为更适宜甜菜碱检测的氨基键合硅胶色谱柱后，在枸杞饮片及三七参蜂口服液渗漉液的检测色谱图中出现甜菜碱色谱峰，但依照制备工艺在渗漉液中加入蜂蜜后，甜菜碱色谱峰消失不见，推测造成此现象的原因为甜菜碱为季铵碱类生物碱，pKa=2.38，具有弱碱性，蜂蜜则富含酸性的有机酸（葡萄糖酸、柠檬酸、乙酸等）和多酚类物质（咖啡酸、没食子酸等），当甜菜碱在水溶液中结合蜂蜜中的酸性物质生成盐时，在C₁₈色谱柱和氨基色谱柱上均无保留，造成三七参蜂口服液指纹图谱中无甜菜碱色谱峰的现象。

利益冲突声明：作者声明本研究不存在任何经济或非经济利益冲突。

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