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Hedgehog信号通路介导白藜芦醇对人胆囊癌GBC-SD细胞株凋亡和侵袭的影响

更新时间:2023年11月14日阅读:758次 下载:460次 下载 手机版

作者: 秦洪莉 1 莫立军 1 张瞳 2 高明 1

作者单位: 1. 北大荒集团红兴隆医院静脉用药集中调配中心(黑龙江双鸭山 155811) 2. 北大荒集团红兴隆医院消化内科(黑龙江双鸭山 155811)

关键词: 白藜芦醇 胆囊癌 GBC-SD细胞株 Hedgehog信号通路 上皮间充质转化 凋亡 侵袭

DOI: 10.19960/j.issn.1005-0698.202311008

引用格式: 秦洪莉,莫立军,张瞳,高明.Hedgehog 信号通路介导白藜芦醇对人胆囊癌 GBC-SD 细胞株凋亡和侵袭的影响[J]. 药物流行病学杂志,2023, 32(11):1250-1258.DOI: 10.19960/j.issn.1005-0698.202311008.

Hong-Li QIN, Li-Jun MO, Tong ZHANG, Ming GAO.Effects of the resveratrol mediated by Hedgehog signaling pathway on the apoptosis and invasion of gallbladder cancer GBC-SD cell line[J].Yaowu Liuxingbingxue Zazhi,2023, 32(11):1250-1258.DOI: 10.19960/j.issn.1005-0698.202311008.[Article in Chinese]

摘要| Abstract

目的  探讨白藜芦醇(RSV)对人胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡、侵袭能力和上皮间充质转化(EMT)的影响及其发生机制。

方法  体外培养GBC-SD细胞,随机分成空白组和RSV低、中、高剂量组(0,20,50,100 μmol·L-1 RSV)。通过Annexin V FITC/PI双染流式分析细胞凋亡情况,RT-PCR检测B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3 (Caspase 3)mRNA表达水平,Transwell侵袭实验检测GBC-SD细胞侵袭能力,Western blotting检测EMT标志物钙黏蛋白E(E-cadherin)、钙黏蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达水平和Hedgehog信号通路成员神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1(Gli1)、Gli2、音猬因子(Shh)的表达。再将GBC-SD细胞随机分为空质粒组、Gli1过表达质粒组、Gli1过表达质粒+RSV组,通过Western blotting检测Gli1蛋白过表达情况,Annexin V-FITC/PI双染流式和Transwell侵袭实验分别检测上述各组的凋亡水平和侵袭能力。

结果  与空白组相比,RSV各剂量组细胞凋亡率、Bax和Caspase 3 mRNA表达显著升高(P<0.05或P<0.01),细胞侵袭能力显著降低(P<0.01);RSV中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与空白组相比,RSV高剂量组E-cadherin蛋白表达水平显著升高,N-cadherin、Vimentin、Gli1、Gli2和Shh蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与转染空质粒+RSV组相比,Gli1过表达质粒+RSV组细胞的凋亡率降低,侵袭能力增加(P<0.001)。

结论  RSV促进GBC-SD细胞凋亡、抑制GBC-SD细胞侵袭及EMT,其作用机制可能与抑制Hedgehog信号相关。

全文| Full-text

胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤之一,占胆道系统恶性肿瘤的80%~85%。目前对这种肿瘤的分子发病机制、调节信号通路和靶向治疗药物等方面研究不足,阻碍了研究者们设计有效策略来应对这种疾病[1]。Hedgehog信号通路在多种肿瘤发生中表达异常,研究[2]发现,胆囊癌组织中多个Hedgehog信号成员表达上调,通过抑制Hedgehog信号通路可以抑制胆囊癌细胞株的侵袭能力,并促进其凋亡,因此Hedgehog信号通路可能是治疗胆囊癌的一个潜在靶点。

白藜芦醇(resveratrol, RSV),又名3,4',5-三羟基二苯乙烯,为天然植物中提取,具有抗微生物、抗氧化、抗炎症等活性,被认为是一种有效、可靠的癌症化学预防和治疗策略[3]。研究[4-5]发现,RSV可以抑制胆囊癌细胞的生长并促进其凋亡,但相关机制尚未得到阐释。RSV的抗肿瘤作用,与其调控多种信号通路密切相关。其中,RSV通过对Hedgehog信号通路的拮抗作用,可以抑制多种肿瘤的发生过程,如胰腺癌、胃癌、卵巢癌等[6-8]。考虑到胆囊癌中Hedgehog信号通路的上调及RSV对Hedgehog信号通路的抑制作用,本课题组推测RSV在胆囊癌中的抗肿瘤作用可能是通过Hedgehog信号通路介导。另外,RSV可以逆转多种肿瘤的上皮间充质转化(EMT)过程,即上皮细胞标志物的丢失,如E-钙黏蛋白(E-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)等,伴间充质细胞标志物的获取,如N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等,但在胆囊癌中是否有这一作用尚不清楚[9]。GBC-SD细胞株是一种常用的胆囊癌细胞株,具有高度侵袭性和一定的干性,常被用于探究药物在胆囊癌中的作用机制[10-11],故本研究通过体外GBC-SD胆囊癌细胞株模型,探究了RSV对GBC-SD细胞株凋亡、侵袭及EMT的调控作用,并进一步探究Hedgehog信号通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

QuantStudio 6 Flex System实时荧光定量PCR仪(Life Technologies公司);SMR16.1酶标仪(Uscnk公司);ND-100分光光度计(杭州米欧仪器有限公司);FACSCantoII流式细胞仪(BD公司);IX51倒置显微镜(Olympus公司)。

RSV(Sigma公司,批号:658741,纯度99.99%);新生胎牛血清(批号:10100147C)、RPMI-1640培养液(Gibco公司,批号:11875093);神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1(Gli1)过表达质粒(批号:NM005269-6)、空质粒(批号:V790-20)购自生物风公司;Lipofectamine 3000转染试剂(Thermo Fisher Scientific,批号:L3000001); Annexin V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(碧云天公司,批号:C1062M);Transwell小室(批号:CLS3399)、Matrigel基质胶(批号:356237)购自康宁公司;E-cadherin抗体(批号:14472)、N-cadherin抗体(批号:13116)、Gli1抗体(批号:3538)、Gli2抗体(批号:2585)购自CST公司;Vimentin抗体(武汉三鹰公司,批号:10366-1-AP);Shh抗体(批号:DF7747)、β-actin抗体(批号:AF7018)和相应二抗(批号:S0001、S002)购自Affinity Biosciences公司;BCA试剂盒(批号:71285-M)、PVDF 膜(批号:IPVH00005)购自 Millipore公司;总RNA提取试剂盒(批号:9767)、RNA逆转录试剂盒(批号:RR037A)、TB Green Fast qPCR Mix(批号:RR430A)购自Takara公司;RT-PCR引物序列均由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.2 细胞

人胆囊癌细胞GBC-SD细胞株(批号:TCHu 16)购自中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、分组处理及质粒过表达

用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养液,在37℃、5% CO2的细胞孵箱中培养GBC-SD细胞,细胞密度达90%~100%后用0.25%胰酶进行消化传代。将5×105个细胞接种于6孔板,当细胞融合度达70%~80%后,用0,20,50,100 μmol·L-1的RSV处理48 h,依次设为空白组(加入等体积DMSO)、RSV低、中、高剂量组。质粒转染方法参照Lipo3000试剂说明书,当细胞融合度达70%~80%左右,分别转染空质粒或Gli1过表达质粒,同时加入高剂量RSV或等体积DMSO孵育48 h后收集细胞进行后续实验。

1.3.2 Annexin V FITC/PI双染法检测细胞凋亡

收集各组细胞,用冷PBS清洗2 次,1X Binding Buffer 重悬后,分别加入 Annexin V和PI处理细胞(按照试剂盒操作说明书进行)并设置空白组(不加染料)、Annexin单染组和PI单染组,最后用流式细胞仪和FlowJo软件分析细胞凋亡情况,即比较右下象限早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)的百分比。

1.3.3 Transwell实验检测细胞侵袭能力

冰上将Matrigel胶与冰PBS按1 ∶ 7进行稀释,取70 μL稀释的Matrigel胶均匀地铺于48孔Transwell 小室上,细胞孵箱放置2 h待胶凝固后,各组取5×104个GBC-SD细胞重悬于200 μL无血清培养基中,接种于Matrigel胶上,下室加入含10% 胎牛血清的完全培养液 800 μL,于孵箱培养48 h,再经甲醇固定,0.1% 结晶紫染色后,用棉签刮除上室面未侵袭的细胞,在显微镜下随机选取 5 个视野观察并拍照,采用 Image J 软件计数穿膜细胞的数量。

1.3.4 Western blotting检测蛋白表达水平

用RIPA 裂解液(含蛋白酶抑制剂)裂解各组细胞并提取总蛋白,采用 BCA 法进行蛋白定量,用5×SDS在100℃下将蛋白变性,在PAGE胶上点样后电泳,转移至PVDF膜,用含5%脱脂牛奶粉 的TBST溶液室温封闭1 h, 分别用E-cadherin(稀释比例1 ∶ 1 000)、N-cadherin(稀释比例1 ∶ 2 000)、Vimentin(稀释比例1 ∶ 5 000)、Gli1(稀释比例1 ∶ 1 000)、Gli2(稀释比例1 ∶ 500)、Shh(稀释比例1 ∶ 1 000)、β-actin(稀释比例1 ∶ 10 000)一抗稀释液4℃孵育过夜, TBST洗涤3次,随后室温摇床上孵育稀释的二抗(稀释比例1 ∶ 10 000)1 h,TBST洗涤3次, ECL 显影,凝胶成像系统中曝光并拍照记录,用Image J软件测量平均灰度值,以目的条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

1.3.5 RT-PCR检测细胞mRNA表达情况

使用 Trizol提取各组细胞的总 RNA,利用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA后,以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测。引物序列如下:Bax 正向:5‘-GCGAATTGGAGAT GAACTGG-3’,反向:5‘-GTGAGCGAGGCGG TGAGGAC-3’;Bcl-2正向:5‘- GCAGAGAT GTCCAGTCAGC-3’,反向:5‘- CCCACCGA ACTCAAAGAAGG-3’;Caspase 3正向:5‘- GCAGCAGCCTCAAATTGTTGACTA-3’,反向:5‘- TGCTCCGGCTCAAACCATC-3’;GAPDH正向:5‘- GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’,反向:5‘- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。PCR 的反应条件为 95℃预变性30 s,95℃变性10 s,60℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40 个循环,72℃延伸60 s。采用 2-ΔΔCt计算 mRNA 相对表达量。

1.4 统计学分析

采用Graphpad Prism软件进行统计分析,实验数据用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 SNK-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV对GBC-SD细胞凋亡的影响

Annexin V FITC/PI双染法检测结果显示,RSV以剂量依赖方式促进GBC-SD细胞的凋亡,其中RSV各剂量组的细胞早期凋亡率显著高于空白组(P<0.01);RSV各剂量间的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。见图1。

  • 图1 不同浓度RSV对GBC-SD细胞株凋亡的影响(n=3)
    Figure 1.The effect of different concentrations of RSV on the apoptosis of GBC-SD cells (n=3)
    注:与空白组比较,aP<0.01;与RSV低剂量组比较,bP<0.05;与RSV中剂量组比较,cP<0.05

RT-PCR结果显示,不同浓度RSV处理GBC-SD细胞48 h后,Bax和Caspase 3 mRNA表达水平与RSV浓度呈正相关,与空白组比较,RSV各剂量组的Bax和Caspase 3 mRNA水平显著升高(P<0.05或P<0.01);而Bcl-2 mRNA水平与RSV浓度呈负相关,与空白组比较,RSV中、高剂量组Bcl-2 mRNA水平显著下降(P<0.01),但低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

  • 图2 不同浓度RSV对GBC-SD细胞株Bax、Caspase3和Bcl-2 mRNA表达的影响(n=3)
    Figure 2.The effect of different concentrations of RSV on the expression of Bax, Caspase3 and Bcl-2 mRNA in GBC-SD cells (n=3)
    注:与空白组比较,aP<0.05,bP<0.01;与RSV低剂量组比较,cP<0.05;与RSV中剂量组比较,dP<0.05

2.2 RSV抑制GBC-SD细胞的侵袭能力

Transwell侵袭实验结果显示,不同浓度梯度RSV处理GBC-SD细胞48 h后,与空白组比较,RSV各剂量组对GBC-SD细胞侵袭能力有明显的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01),且不同剂量组之间的差异也有统计学意义(P<0.01),见图3。

  • 图3 不同浓度RSV对GBC-SD细胞株侵袭能力的影响(n=3)
    Figure 3.The effect of different concentrations of RSV on the invasion ability of GBC-SD cells (n=3)
    注:与空白组比较,aP<0.01;与RSV低剂量组比较,bP<0.01;与RSV中剂量组比较,cP<0.01

考虑到上述不同剂量RSV对GBC-SD细胞凋亡和侵袭行为的影响结果,拟进一步采用效果更明显的高剂量组,并通过检测EMT相关蛋白的表达情况,观察RSV对GBC-SD细胞EMT行为的影响。Western blotting结果显示,RSV高剂量组处理GBC-SD细胞48 h后,间充质细胞相关标记物 Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平较空白组显著降低(P<0.01),而上皮细胞相关标记物E-cadherin蛋白表达水平较空白组显著升高(P<0.01),见图4。

  • 图4 高浓度RSV对GBC-SD细胞株E-cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白表达的影响(n=3)
    Figure 4.The effect of high dose of RSV on the expression of E-cadherin, N-Cadherin and Vimentin proteins in GBC-SD cells (n=3)
    注:与空白组比较,aP<0.01

2.3 RSV抑制了GBC-SD细胞的Hedgehog信号通路

本研究进一步选择了对GBC-SD细胞促凋亡效果最明显的RSV高剂量组来观察RSV处理细胞后Hedgehog信号通路相关蛋白表达水平变化。Western blotting结果显示,与空白组比较,RSV高剂量组Gli1、Gli2和Shh蛋白水平显著降低(P<0.01),见图5。

  • 图5 高浓度RSV对GBC-SD细胞株Gli1、Gli2、Shh蛋白表达的影响(n=3)
    Figure 5.The effect of high dose of RSV on the expression of Gli1, Gli2, Shh proteins in GBC-SD cells (n=3)
    注:与空白组比较,aP<0.01

2.4 上调Gli1逆转RSV对GBC-SD细胞凋亡的促进作用及对GBC-SD细胞侵袭的抑制作用

本研究进一步观察上调Gli蛋白后能否逆转RSV对GBC-SD细胞凋亡、侵袭的影响。Western blotting结果显示,转染Gli1过表达质粒的GBC-SD细胞较转染对照空质粒的GBC-SD细胞,Gli1蛋白水平显著升高(P<0.01),见图6。

  • 图6 转染Gli1过表达质粒对GBC-SD细胞株Gli1蛋白表达的影响(n=3)
    Figure 6.The effect of transfecting Gli1 overexpression vector on the expression of Gli1 protein in GBC-SD cells (n=3)
    注:与空质粒比较,aP<0.01

Annexin V FITC/PI双染法结果显示,相较于单纯转染空质粒组,转染空质粒同时加入RSV高剂量组的凋亡率显著增加(P<0.01)。相较于转染空质粒同时加入高剂量RSV组,转染Gli1质粒同时加入高剂量RSV组的凋亡率显著减少(P<0.01),见图7。Transwell侵袭实验结果显示,相较于转染空质粒同时加入高剂量RSV组,转染Gli1质粒同时加入高剂量RSV组的穿膜细胞数量显著增加(P<0.01),见图8。

  • 图7 转染Gli1过表达质粒对RSV处理后GBC-SD细胞株凋亡的影响(n=3)
    Figure 7.The effect of transfecting Gli1 overexpression vector on the apoptosis of GBC-SD cells treated with RSV (n=3)
    注:与空质粒比较,aP<0.01;与RSV+空质粒比较,bP<0.01

  • 图8 转染Gli1过表达质粒对RSV处理后GBC-SD侵袭能力的影响(n=3)
    Figure 8.The effect of transfecting Gli1 overexpression vector on the invasion ability of GBC-SD cells treated with RSV (n=3)
    注:与空质粒比较,aP<0.01;与RSV+空质粒比较,bP<0.01

3 讨论

胆囊癌是一种罕见的肿瘤,发病率为2.5/10万人,其进展的危险因素包括胆结石、慢性炎症和异常胰胆管连接的存在。胆囊癌的病程长达5~15年,其早期临床表现无特异性,难以及时诊断,发展到晚期后患者往往预后差[12]。在进展性胆囊癌病例中,标准治疗方案为吉西他滨联合顺铂化疗,但该方案对患者总体生存率效果不明显。目前对胆囊癌的肿瘤发生知识存在很大的空白,因此需要进一步探索胆囊癌发展的分子机制,并挖掘出有效的生物标志物和新的治疗突破,并最终改善这种致命疾病的预后[13]。

RSV是一种天然的植物来源化合物,通过促进凋亡和抑制EMT等作用达到抑制癌症的效果[3]。研究[5,14]表明,RSV可以抑制胆囊癌细胞株的生长并促进其凋亡,但具体的分子机制尚不清楚。本实验结果同样证实,RSV可以促进GBC-SD细胞凋亡,同时上调促凋亡基因Bax、Caspase 3 mRNA表达并下调抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表达,且这种促凋亡作用存在剂量依赖效应,浓度达100 μmol·L-1时效果最强。EMT是胆囊癌进展过程中显著的病理特征,即极化的胆囊上皮细胞向间充质细胞转化的过程,EMT也是导致细胞侵袭能力增加的原因之一[15]。为了进一步探究RSV能否抑制GBC-SD细胞的侵袭能力和EMT,本研究通过侵袭实验和Western blotting法证明了RSV同样以剂量依赖的方式减弱GBC-SD细胞的侵袭能力并抑制EMT,提示RSV可以通过多方面作用抑制胆囊癌的发展。

Hedgehog信号因发现其与多种炎症性疾病和恶性肿瘤有关而受到广泛研究。Hedgehog通路由膜蛋白受体PTCH和7次跨膜G蛋白偶联受体家族成员Smoothened 组成。Smoothened的下游信号是胶质瘤相关致癌因子Gli1、Gli 2和Gli 3,其中,Gli1是一种转录激活因子。研究[16]表明,Hedgehog信号通路在慢性胆囊炎和GBC中异常激活, Hedgehog信号通路的改变可能参与了胆囊炎向胆囊癌变的发展过程。Hedgehog信号通路可以调控EMT [17]。沉默GBC-SD细胞株的SNHG6 LncRNA后,可以抑制Shh信号通路及EMT,从而下调胆囊癌细胞的增殖、侵袭能力[18]。另外,Gli1蛋白被发现可以正向调控胆囊癌细胞的侵袭能力[19],这些结果均提示Hedgehog信号通路与胆囊癌的肿瘤发生密切相关。

为了探索RSV促进GBC-SD细胞凋亡和抑制GBC-SD细胞侵袭的分子机制是否与Hedgehog信号通路相关,本实验首先检测了GBC-SD细胞经RSV诱导后Hedgehog信号通路相关成员的蛋白水平变化。结果显示,RSV高剂量组显著下调GBC-SD细胞中Gli1、Gli2、Shh蛋白表达水平,提示RSV处理GBC-SD细胞后,Shh信号通路受到了抑制。为了进一步探索下调的Hedgehog信号通路是否介导RSV对GBC-SD细胞的抑癌作用,观察了过表达Gli1基因能否逆转RSV对GBC-SD细胞的凋亡诱导及侵袭抑制的作用。结果显示,过表达Gli1蛋白能够部分逆转RSV对GBC-SD细胞的凋亡诱导及侵袭抑制的作用,提示Hedgehog信号通路可能是调控RSV影响GBC-SD细胞凋亡和侵袭的潜在机制。

综上所述,本研究证明了下调的Hedgehog信号通路部分介导了RSV对GBC-SD细胞的凋亡诱导和侵袭抑制作用,而RSV对GBC-SD细胞凋亡和侵袭的影响存在剂量依赖效应。同时,RSV还可以抑制GBC-SD细胞的EMT。提示,RSV可以从多方面抑制GBC-SD细胞的肿瘤发生。本研究为RSV治疗胆囊癌涉及的分子机制提供了新思路。

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