目的  探讨白藜芦醇（RSV）对人胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡、侵袭能力和上皮间充质转化（EMT）的影响及其发生机制。

方法  体外培养GBC-SD细胞，随机分成空白组和RSV低、中、高剂量组（0，20，50，100 μmol·L^-1 RSV）。通过Annexin V FITC/PI双染流式分析细胞凋亡情况，RT-PCR检测B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3 （Caspase 3）mRNA表达水平，Transwell侵袭实验检测GBC-SD细胞侵袭能力，Western blotting检测EMT标志物钙黏蛋白E（E-cadherin）、钙黏蛋白N（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表达水平和Hedgehog信号通路成员神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1（Gli1）、Gli2、音猬因子（Shh）的表达。再将GBC-SD细胞随机分为空质粒组、Gli1过表达质粒组、Gli1过表达质粒+RSV组，通过Western blotting检测Gli1蛋白过表达情况，Annexin V-FITC/PI双染流式和Transwell侵袭实验分别检测上述各组的凋亡水平和侵袭能力。

结果  与空白组相比，RSV各剂量组细胞凋亡率、Bax和Caspase 3 mRNA表达显著升高（P＜0.05或P＜0.01），细胞侵袭能力显著降低（P＜0.01）；RSV中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达显著降低（P＜0.01）。与空白组相比，RSV高剂量组E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin、Vimentin、Gli1、Gli2和Shh蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与转染空质粒+RSV组相比，Gli1过表达质粒+RSV组细胞的凋亡率降低，侵袭能力增加（P＜0.001）。

结论  RSV促进GBC-SD细胞凋亡、抑制GBC-SD细胞侵袭及EMT，其作用机制可能与抑制Hedgehog信号相关。

胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤之一，占胆道系统恶性肿瘤的80%~85%。目前对这种肿瘤的分子发病机制、调节信号通路和靶向治疗药物等方面研究不足，阻碍了研究者们设计有效策略来应对这种疾病[1]。Hedgehog信号通路在多种肿瘤发生中表达异常，研究[2]发现，胆囊癌组织中多个Hedgehog信号成员表达上调，通过抑制Hedgehog信号通路可以抑制胆囊癌细胞株的侵袭能力，并促进其凋亡，因此Hedgehog信号通路可能是治疗胆囊癌的一个潜在靶点。

白藜芦醇（resveratrol, RSV），又名3,4',5-三羟基二苯乙烯，为天然植物中提取，具有抗微生物、抗氧化、抗炎症等活性，被认为是一种有效、可靠的癌症化学预防和治疗策略[3]。研究[4-5]发现，RSV可以抑制胆囊癌细胞的生长并促进其凋亡，但相关机制尚未得到阐释。RSV的抗肿瘤作用，与其调控多种信号通路密切相关。其中，RSV通过对Hedgehog信号通路的拮抗作用，可以抑制多种肿瘤的发生过程，如胰腺癌、胃癌、卵巢癌等[6-8]。考虑到胆囊癌中Hedgehog信号通路的上调及RSV对Hedgehog信号通路的抑制作用，本课题组推测RSV在胆囊癌中的抗肿瘤作用可能是通过Hedgehog信号通路介导。另外，RSV可以逆转多种肿瘤的上皮间充质转化（EMT）过程，即上皮细胞标志物的丢失，如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、β-连环蛋白（β-catenin）等，伴间充质细胞标志物的获取，如N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等，但在胆囊癌中是否有这一作用尚不清楚[9]。GBC-SD细胞株是一种常用的胆囊癌细胞株，具有高度侵袭性和一定的干性，常被用于探究药物在胆囊癌中的作用机制[10-11]，故本研究通过体外GBC-SD胆囊癌细胞株模型，探究了RSV对GBC-SD细胞株凋亡、侵袭及EMT的调控作用，并进一步探究Hedgehog信号通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

QuantStudio 6 Flex System实时荧光定量PCR仪（Life Technologies公司）；SMR16.1酶标仪（Uscnk公司）；ND-100分光光度计（杭州米欧仪器有限公司）；FACSCantoII流式细胞仪（BD公司）；IX51倒置显微镜（Olympus公司）。

RSV（Sigma公司，批号：658741，纯度99.99%）；新生胎牛血清（批号：10100147C）、RPMI-1640培养液（Gibco公司，批号：11875093）；神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1（Gli1）过表达质粒（批号：NM005269-6）、空质粒（批号：V790-20）购自生物风公司；Lipofectamine 3000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，批号：L3000001）； Annexin V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司，批号：C1062M）；Transwell小室（批号：CLS3399）、Matrigel基质胶（批号：356237）购自康宁公司；E-cadherin抗体（批号：14472）、N-cadherin抗体（批号：13116）、Gli1抗体（批号：3538）、Gli2抗体（批号：2585）购自CST公司；Vimentin抗体（武汉三鹰公司，批号：10366-1-AP）；Shh抗体（批号：DF7747）、β-actin抗体（批号：AF7018）和相应二抗（批号：S0001、S002）购自Affinity Biosciences公司；BCA试剂盒（批号：71285-M）、PVDF 膜（批号：IPVH00005）购自 Millipore公司；总RNA提取试剂盒（批号：9767）、RNA逆转录试剂盒（批号：RR037A）、TB Green Fast qPCR Mix（批号：RR430A）购自Takara公司；RT-PCR引物序列均由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.2 细胞

人胆囊癌细胞GBC-SD细胞株（批号：TCHu 16）购自中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、分组处理及质粒过表达

用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养液，在37℃、5% CO2的细胞孵箱中培养GBC-SD细胞，细胞密度达90%~100%后用0.25%胰酶进行消化传代。将5×105个细胞接种于6孔板，当细胞融合度达70%~80%后，用0，20，50，100 μmol·L^-1的RSV处理48 h，依次设为空白组（加入等体积DMSO）、RSV低、中、高剂量组。质粒转染方法参照Lipo3000试剂说明书，当细胞融合度达70%~80%左右，分别转染空质粒或Gli1过表达质粒，同时加入高剂量RSV或等体积DMSO孵育48 h后收集细胞进行后续实验。

1.3.2 Annexin V FITC/PI双染法检测细胞凋亡

收集各组细胞，用冷PBS清洗2 次，1X Binding Buffer 重悬后，分别加入 Annexin V和PI处理细胞（按照试剂盒操作说明书进行）并设置空白组（不加染料）、Annexin单染组和PI单染组，最后用流式细胞仪和FlowJo软件分析细胞凋亡情况，即比较右下象限早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）的百分比。

1.3.3 Transwell实验检测细胞侵袭能力

冰上将Matrigel胶与冰PBS按1 ∶ 7进行稀释，取70 μL稀释的Matrigel胶均匀地铺于48孔Transwell 小室上，细胞孵箱放置2 h待胶凝固后，各组取5×104个GBC-SD细胞重悬于200 μL无血清培养基中，接种于Matrigel胶上，下室加入含10% 胎牛血清的完全培养液 800 μL，于孵箱培养48 h，再经甲醇固定，0.1% 结晶紫染色后，用棉签刮除上室面未侵袭的细胞，在显微镜下随机选取 5 个视野观察并拍照，采用 Image J 软件计数穿膜细胞的数量。

1.3.4 Western blotting检测蛋白表达水平

用RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解各组细胞并提取总蛋白，采用 BCA 法进行蛋白定量，用5×SDS在100℃下将蛋白变性，在PAGE胶上点样后电泳，转移至PVDF膜，用含5%脱脂牛奶粉 的TBST溶液室温封闭1 h， 分别用E-cadherin（稀释比例1 ∶ 1 000）、N-cadherin（稀释比例1 ∶ 2 000）、Vimentin（稀释比例1 ∶ 5 000）、Gli1（稀释比例1 ∶ 1 000）、Gli2（稀释比例1 ∶ 500）、Shh（稀释比例1 ∶ 1 000）、β-actin（稀释比例1 ∶ 10 000）一抗稀释液4℃孵育过夜， TBST洗涤3次，随后室温摇床上孵育稀释的二抗（稀释比例1 ∶ 10 000）1 h，TBST洗涤3次， ECL 显影，凝胶成像系统中曝光并拍照记录，用Image J软件测量平均灰度值，以目的条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

1.3.5 RT-PCR检测细胞mRNA表达情况

使用 Trizol提取各组细胞的总 RNA，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA后，以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测。引物序列如下：Bax 正向：5‘-GCGAATTGGAGAT GAACTGG-3’，反向：5‘-GTGAGCGAGGCGG TGAGGAC-3’；Bcl-2正向：5‘- GCAGAGAT GTCCAGTCAGC-3’，反向：5‘- CCCACCGA ACTCAAAGAAGG-3’；Caspase 3正向：5‘- GCAGCAGCCTCAAATTGTTGACTA-3’，反向：5‘- TGCTCCGGCTCAAACCATC-3’；GAPDH正向：5‘- GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，反向：5‘- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。PCR 的反应条件为 95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环，72℃延伸60 s。采用 2-ΔΔCt计算 mRNA 相对表达量。

1.4 统计学分析

采用Graphpad Prism软件进行统计分析，实验数据用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV对GBC-SD细胞凋亡的影响

Annexin V FITC/PI双染法检测结果显示，RSV以剂量依赖方式促进GBC-SD细胞的凋亡，其中RSV各剂量组的细胞早期凋亡率显著高于空白组（P＜0.01）；RSV各剂量间的细胞凋亡率差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

• 
  图1 不同浓度RSV对GBC-SD细胞株凋亡的影响（n=3）

  Figure 1.The effect of different concentrations of RSV on the apoptosis of GBC-SD cells (n=3)

  注：与空白组比较，aP＜0.01；与RSV低剂量组比较，bP＜0.05；与RSV中剂量组比较，cP＜0.05

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RT-PCR结果显示，不同浓度RSV处理GBC-SD细胞48 h后，Bax和Caspase 3 mRNA表达水平与RSV浓度呈正相关，与空白组比较，RSV各剂量组的Bax和Caspase 3 mRNA水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而Bcl-2 mRNA水平与RSV浓度呈负相关，与空白组比较，RSV中、高剂量组Bcl-2 mRNA水平显著下降（P＜0.01），但低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

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  图2 不同浓度RSV对GBC-SD细胞株Bax、Caspase3和Bcl-2 mRNA表达的影响（n=3）

  Figure 2.The effect of different concentrations of RSV on the expression of Bax, Caspase3 and Bcl-2 mRNA in GBC-SD cells (n=3)

  注：与空白组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与RSV低剂量组比较，cP＜0.05；与RSV中剂量组比较，dP＜0.05

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2.2 RSV抑制GBC-SD细胞的侵袭能力

Transwell侵袭实验结果显示，不同浓度梯度RSV处理GBC-SD细胞48 h后，与空白组比较，RSV各剂量组对GBC-SD细胞侵袭能力有明显的抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.01），且不同剂量组之间的差异也有统计学意义（P＜0.01），见图3。

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  图3 不同浓度RSV对GBC-SD细胞株侵袭能力的影响（n=3）

  Figure 3.The effect of different concentrations of RSV on the invasion ability of GBC-SD cells (n=3)

  注：与空白组比较，aP＜0.01；与RSV低剂量组比较，bP＜0.01；与RSV中剂量组比较，cP＜0.01

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考虑到上述不同剂量RSV对GBC-SD细胞凋亡和侵袭行为的影响结果，拟进一步采用效果更明显的高剂量组，并通过检测EMT相关蛋白的表达情况，观察RSV对GBC-SD细胞EMT行为的影响。Western blotting结果显示，RSV高剂量组处理GBC-SD细胞48 h后，间充质细胞相关标记物 Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平较空白组显著降低（P＜0.01），而上皮细胞相关标记物E-cadherin蛋白表达水平较空白组显著升高（P＜0.01），见图4。

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  图4 高浓度RSV对GBC-SD细胞株E-cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白表达的影响（n=3）

  Figure 4.The effect of high dose of RSV on the expression of E-cadherin, N-Cadherin and Vimentin proteins in GBC-SD cells (n=3)

  注：与空白组比较，aP＜0.01

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2.3 RSV抑制了GBC-SD细胞的Hedgehog信号通路

本研究进一步选择了对GBC-SD细胞促凋亡效果最明显的RSV高剂量组来观察RSV处理细胞后Hedgehog信号通路相关蛋白表达水平变化。Western blotting结果显示，与空白组比较，RSV高剂量组Gli1、Gli2和Shh蛋白水平显著降低（P＜0.01），见图5。

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  图5 高浓度RSV对GBC-SD细胞株Gli1、Gli2、Shh蛋白表达的影响（n=3）

  Figure 5.The effect of high dose of RSV on the expression of Gli1, Gli2, Shh proteins in GBC-SD cells (n=3)

  注：与空白组比较，aP＜0.01

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2.4 上调Gli1逆转RSV对GBC-SD细胞凋亡的促进作用及对GBC-SD细胞侵袭的抑制作用

本研究进一步观察上调Gli蛋白后能否逆转RSV对GBC-SD细胞凋亡、侵袭的影响。Western blotting结果显示，转染Gli1过表达质粒的GBC-SD细胞较转染对照空质粒的GBC-SD细胞，Gli1蛋白水平显著升高（P＜0.01），见图6。

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  图6 转染Gli1过表达质粒对GBC-SD细胞株Gli1蛋白表达的影响（n=3）

  Figure 6.The effect of transfecting Gli1 overexpression vector on the expression of Gli1 protein in GBC-SD cells (n=3)

  注：与空质粒比较，aP＜0.01

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Annexin V FITC/PI双染法结果显示，相较于单纯转染空质粒组，转染空质粒同时加入RSV高剂量组的凋亡率显著增加（P＜0.01）。相较于转染空质粒同时加入高剂量RSV组，转染Gli1质粒同时加入高剂量RSV组的凋亡率显著减少（P＜0.01），见图7。Transwell侵袭实验结果显示，相较于转染空质粒同时加入高剂量RSV组，转染Gli1质粒同时加入高剂量RSV组的穿膜细胞数量显著增加（P＜0.01），见图8。

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  图7 转染Gli1过表达质粒对RSV处理后GBC-SD细胞株凋亡的影响（n=3）

  Figure 7.The effect of transfecting Gli1 overexpression vector on the apoptosis of GBC-SD cells treated with RSV (n=3)

  注：与空质粒比较，aP＜0.01；与RSV+空质粒比较，bP＜0.01

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  图8 转染Gli1过表达质粒对RSV处理后GBC-SD侵袭能力的影响（n=3）

  Figure 8.The effect of transfecting Gli1 overexpression vector on the invasion ability of GBC-SD cells treated with RSV (n=3)

  注：与空质粒比较，aP＜0.01；与RSV+空质粒比较，bP＜0.01

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3 讨论

胆囊癌是一种罕见的肿瘤，发病率为2.5/10万人，其进展的危险因素包括胆结石、慢性炎症和异常胰胆管连接的存在。胆囊癌的病程长达5~15年，其早期临床表现无特异性，难以及时诊断，发展到晚期后患者往往预后差[12]。在进展性胆囊癌病例中，标准治疗方案为吉西他滨联合顺铂化疗，但该方案对患者总体生存率效果不明显。目前对胆囊癌的肿瘤发生知识存在很大的空白，因此需要进一步探索胆囊癌发展的分子机制，并挖掘出有效的生物标志物和新的治疗突破，并最终改善这种致命疾病的预后[13]。

RSV是一种天然的植物来源化合物，通过促进凋亡和抑制EMT等作用达到抑制癌症的效果[3]。研究[5,14]表明，RSV可以抑制胆囊癌细胞株的生长并促进其凋亡，但具体的分子机制尚不清楚。本实验结果同样证实，RSV可以促进GBC-SD细胞凋亡，同时上调促凋亡基因Bax、Caspase 3 mRNA表达并下调抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表达，且这种促凋亡作用存在剂量依赖效应，浓度达100 μmol·L^-1时效果最强。EMT是胆囊癌进展过程中显著的病理特征，即极化的胆囊上皮细胞向间充质细胞转化的过程，EMT也是导致细胞侵袭能力增加的原因之一[15]。为了进一步探究RSV能否抑制GBC-SD细胞的侵袭能力和EMT，本研究通过侵袭实验和Western blotting法证明了RSV同样以剂量依赖的方式减弱GBC-SD细胞的侵袭能力并抑制EMT，提示RSV可以通过多方面作用抑制胆囊癌的发展。

Hedgehog信号因发现其与多种炎症性疾病和恶性肿瘤有关而受到广泛研究。Hedgehog通路由膜蛋白受体PTCH和7次跨膜G蛋白偶联受体家族成员Smoothened 组成。Smoothened的下游信号是胶质瘤相关致癌因子Gli1、Gli 2和Gli 3，其中，Gli1是一种转录激活因子。研究[16]表明，Hedgehog信号通路在慢性胆囊炎和GBC中异常激活， Hedgehog信号通路的改变可能参与了胆囊炎向胆囊癌变的发展过程。Hedgehog信号通路可以调控EMT [17]。沉默GBC-SD细胞株的SNHG6 LncRNA后，可以抑制Shh信号通路及EMT，从而下调胆囊癌细胞的增殖、侵袭能力[18]。另外，Gli1蛋白被发现可以正向调控胆囊癌细胞的侵袭能力[19]，这些结果均提示Hedgehog信号通路与胆囊癌的肿瘤发生密切相关。

为了探索RSV促进GBC-SD细胞凋亡和抑制GBC-SD细胞侵袭的分子机制是否与Hedgehog信号通路相关，本实验首先检测了GBC-SD细胞经RSV诱导后Hedgehog信号通路相关成员的蛋白水平变化。结果显示，RSV高剂量组显著下调GBC-SD细胞中Gli1、Gli2、Shh蛋白表达水平，提示RSV处理GBC-SD细胞后，Shh信号通路受到了抑制。为了进一步探索下调的Hedgehog信号通路是否介导RSV对GBC-SD细胞的抑癌作用，观察了过表达Gli1基因能否逆转RSV对GBC-SD细胞的凋亡诱导及侵袭抑制的作用。结果显示，过表达Gli1蛋白能够部分逆转RSV对GBC-SD细胞的凋亡诱导及侵袭抑制的作用，提示Hedgehog信号通路可能是调控RSV影响GBC-SD细胞凋亡和侵袭的潜在机制。

综上所述，本研究证明了下调的Hedgehog信号通路部分介导了RSV对GBC-SD细胞的凋亡诱导和侵袭抑制作用，而RSV对GBC-SD细胞凋亡和侵袭的影响存在剂量依赖效应。同时，RSV还可以抑制GBC-SD细胞的EMT。提示，RSV可以从多方面抑制GBC-SD细胞的肿瘤发生。本研究为RSV治疗胆囊癌涉及的分子机制提供了新思路。

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