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目的 基于网络药理学与生物信息学技术探讨丹参-黄芪调节自噬防治糖尿病心肌病（DCM）的活性成分及构建长链非编码RNA（lncRNA） -微小RNA（miRNA）-信使RNA（mRNA）转录网络。
方法 利用TCMSP数据库检索丹参-黄芪的化学成分及靶点；通过CTD、GeneCards数据库筛选获得DCM和自噬的相关靶点；STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络并进行网络拓扑分析；通过Cytoscape软件中的Hubba插件5种算法筛选核心靶点；通过Metascape数据库对靶点进行基因本体和京都基因与基因组百科全书富集分析；利用微生信平台构建中药核心成分-核心靶点-核心信号通路网络；用Discovery Studio Client 19.1.0 软件进行分子对接；用Target Scan Human、miRDB、miRTarBase数据库预测靶点mRNA上游调控的miRNAs并筛选核心miRNA；StarBase数据库预测miRNA竞争性结合的lncRNAs并筛选得到核心lncRNA，构建竞争性內源RNA网络。
结果 丹参-黄芪中调节自噬防治DCM的活性成分为丹酚酸J、丹参酮ⅡB、丹参二醇A、黄芪异黄烷苷等；其核心靶点为原癌基因、生长因子受体结合蛋白2等；核心通路为磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、叉头转录因子、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体等；基于核心靶点mRNA预测的核心miRNA为miR-4731-5p、miR-503-5p等12个；核心lncRNA为NEAT1、XIST等5个。
结论 丹参-黄芪可能通过调节自噬影响细胞凋亡、氧化应激、糖代谢等过程协同发挥作用，从而达到防治DCM的作用。
世界卫生组织预测到2030年，糖尿病将成为危害人类健康的主要疾病之一。据统计，糖尿病患者发生心力衰竭的风险是非糖尿病患者的2倍以上，约占糖尿病患者总人数的39%[1]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）已成为糖尿病患者死亡率升高的主要原因之一[2]。现代医学认为，DCM是糖尿病患者在排除高血压性心脏病、冠状动脉疾病和瓣膜性心脏病等基础性心血管疾病的情况下，发生的一种心功能障碍性疾病，特点为心室肥大、心肌纤维化和心功能不全，最终诱发心力衰竭[3-4]。由于心脏功能及内环境复杂，DCM的发病机制也较复杂，常与线粒体功能障碍、氧化应激、炎症、自噬、心脏代谢紊乱等有关[4]。自噬为机体一种高度保守的分解代谢过程。在心肌细胞中，自噬通过活化溶酶体，参与细胞质及细胞器代谢物质的清除和再利用过程[5]。自噬对维持心脏组织细胞活力和功能稳态至关重要[5]，然而临床中发现，糖尿病前期患者的心脏组织已经出现了自噬失调的现象，自噬水平高低与糖尿病分型、发展阶段以及血糖水平密切相关，且患者心脏自噬水平的降低和过度激活，均可能导致DCM的发生。适量水平的自噬有利于恢复糖尿病患者的心脏内环境稳态，而自噬损伤和过度活化均可导致糖尿病心脏的结构和功能障碍[1]。
中医学将DCM归为“消渴胸痹、心痛”等范畴[6]。《灵枢·师传》指出，“胃中热则消谷，令人悬心善饥”的消渴病会导致 “气满发逆”症状[7]。张仲景在《伤寒论·辨厥阴病脉证并治第十二》中进一步阐述了消渴病的心痛症状及虚热病机“厥阴之为病，消渴，气上撞心，心中疼热，饥而不欲食，食则吐蛔，下之利不止”[8]。因此“热、虚、瘀”导致消渴心络痹阻为DCM的主要病机，治疗多以益气养阴、活血化瘀为主[6]。中药复方以其多成分、多靶点、多通路协同作用的特点在DCM的预防和治疗中广泛应用[9-10]。临床用于DCM治疗的常用复方包括益气养阴活血方、芪参益气滴丸、糖心舒合剂、心衰宁合剂等，丹参-黄芪为复方防治DCM的常用药对[10]。丹参归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，用于治疗症瘕积聚、胸痹心痛、心烦不眠等症[11]。黄芪善补脾肺之气，气足则阳生，阴有所根，以促津液输布，达益阴生津之效[12]。现代药理学研究[13]表明，丹参-黄芪作为益气活血通络的代表药对，可保护缺血性心肌，通过调控自噬保护心肌细胞与线粒体形态结构，维持细胞能量代谢稳态等。
竞争性内源RNA（ceRNA）是一种转录水平上的调控机制[14]。长链非编码RNAs（lncRNA）通过与微小RNAs（miRNAs）上的反应元件竞争性结合，阻止miRNA对靶基因信使RNA（mRNA）的沉默效应，以实现在转录水平上对mRNA表达的调控作用[14]。miRNA是单链的非编码RNA，长度约为22个核苷酸，具有转录后调控活性[15]。ceRNA的调控机制参与DCM心肌细胞线粒体功能、活性氧生成、Ca2+处理、凋亡、自噬和纤维化过程，被视为糖尿病导致的心肌肥厚、重塑和纤维化的重要机制[4,16-17]。
本文拟通过网络药理学结合生物信息学技术，构建益气活血通络药对“丹参-黄芪”调节DCM自噬的相关lncRNA-miRNA-mRNA转录网络，为丹参-黄芪复方配伍及组分配伍的临床应用与新药研发提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 丹参-黄芪活性成分和靶点预测
使用TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库，查找两个药材的有效成分，分别筛选出口服生物利用度（OB）≥30%并且类药性（DL）≥ 0.18的成分，并下载其 2D 或 3D 结构（SDF格式）建立丹参-黄芪成分数据库。再将丹参-黄芪化学成分的 SDF 结构导入PharmMapper （http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库，进行反向药效团匹配，选择“Human Protein Targets Only”。使用 UniProt（https://beta.uniprot.org/）数据库进行靶点-基因名转换获得药物主要活性成分的预测靶点。
1.2 丹参-黄芪治疗疾病的潜在靶点交集图
在CTD数据库（http://ctdbase.org/）和GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中分别以“diabetic cardiomyopathy”与“autophagy”为关键词进行靶点筛查，获得DCM自噬的潜在基因靶点。将丹参-黄芪与DCM自噬相关靶点导入微生信分析平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行韦恩分析，得到交集，即为丹参-黄芪通过调节自噬防治DCM的潜在靶点。
1.3 绘制丹参-黄芪治疗疾病靶点网络图和蛋白质-蛋白质相互作用网络
将丹参-黄芪活性成分与所得治疗疾病潜在交集靶点导入Cytoscape 3.7.1软件中，绘制药物-成分-疾病靶点网络图。将交集靶点导入 STRING（https://cn.string-db.org/）数据库进行分析，绘制蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并在Cytoscape 3.7.1进行拓扑分析。以 Hubba 插件中最大集团中心度（MCC）、最大邻域分量（MNC）、边缘渗透组件（EPC）、度（degree）与接近中心性（closeness）5种算法分别选出排名前10的核心靶点[18]。
1.4 富集分析
将核心靶点导入Metascape数据库（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG） 富集分析。GO富集分析包括分子功能（MF）、生物学过程（BP）、细胞学组分（CC）3个部分。KEGG通路富集分析筛选出药物调节自噬防治DCM的相关信号通路。
1.5 分子对接
从PDB蛋白数据库（http://www.pdb.org/）中下载与DCM自噬相关的重要受体蛋白的晶体结构并去除水分子，优化受体蛋白。将TCMSP数据库中下载的化合物2D结构打开，利用 Discovery Studio Client 19.1.0 软件中“Small Molecules”项下的“Prepare Ligand”对小分子化合物进行优化，使用“Receptor-Ligand Interactions”项下的 LibDock 程序进行分子对接，预测两者的结合性能，以 LibCode Score作为评分标准，预测其结合活性。
1.6 中药核心成分-核心靶点-信号通路网络
将核心成分、潜在靶点与KEGG分析所得潜在信号通路Top 5导入微生信平台中，得到药物调节自噬防治DCM的中药核心成分-核心靶点-信号通路网络。
1.7 核心miRNA与lncRNA的预测及ceRNA网络构建
将核心靶点的mRNA导入Target Scan Human（www.targetscan.org/）、miRDB（www.mirdb.org/mirdb/）及miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu. edu.tw/）数据库，得到潜在miRNA。将核心mRNA与潜在miRNA导入Cytoscape软件，得到 mRNA-miRNA网络。在Hubba 插件中采用MCC、EPC、degree与closeness 4种算法分别筛选排名前14位的miRNA并取交集核心miRNA。采用同样方法预测与核心miRNA竞争结合的核心lncRNA获得miRNA-lncRNA网络。将丹参-黄芪通过调节自噬防治DCM的核心mRNA、核心miRNA与核心lncRNA，导入微生信分析平台，构建ceRNA网络。
1.8 构建“丹参-黄芪”成分-mRNA-miRNA-lncRNA网络
将丹参-黄芪活性成分、调节自噬防治DCM的预测靶点mRNA、预测核心miRNA与lncRNA在Cytoscape软件中构建丹参-黄芪活性成分、预测靶点mRAN、核心miRNA与核心lncRNA网络。
2 结果
2.1 丹参-黄芪活性成分及预测靶点
按照TCMSP数据库中药活性成分筛选条件，获得丹参65个、黄芪20个活性成分，经PharmMapper数据库预测后，得到丹参靶点 438个，黄芪靶点434个。
2.2 丹参-黄芪治疗疾病的潜在靶点交集图
通过CTD与GeneCards数据库按照“diabetic cardiomyopathy”与“autophagy”为关键词搜索，去除重复项，找到DCM基因靶点7 340个，自噬基因靶点3 852个。将成分靶点、DCM基因靶点、自噬相关靶点分别导入微生信平台绘制韦恩图，可获得共同靶点156个。见图1。
2.3 中药-成分-疾病靶点网络与PPI
将丹参-黄芪通过自噬防治DCM的156个靶点，导入可视化软件Cytoscape 3.7.1软件中，绘制中药-成分-疾病靶点网络图，见图2。丹参-黄芪调节自噬防治DCM的PPI网络前50个靶点的结果见图3，该网络包括50个节点，433条边，degree 值的中位数为15.5；使用Hubba 插件中MCC、MNC、EPC、degree与closeness 5种算法，筛选网络中排名前10位靶点确定为丹参-黄芪调节自噬防治DCM的关键靶基因，见图4，圆形代表mRNA，颜色越红，与其他靶点的关联性越高。针对5种算法获得的关键靶点，绘制韦恩图得到核心靶点mRNAs共6个，分别为原癌基因（SRC）、生长因子受体结合蛋白2（GRB2）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基1（PIK3R1）、 表皮生长因子受体（EGFR）、V-Ha-Ras肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS），见图5。
2.4 靶点功能分析
将药物与疾病潜在交集靶点导入 Metascape 数据库进行 GO 富集分析，设置 P＜0.05，共映射到26条GO条目，其中BP有10条，CC有6条，MF有10条，BP主要包括蛋白质磷酸化、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、酶联受体蛋白信号通路、细胞对脂质的反应、激酶活性的调节、蛋白质磷酸化的正调节等；CC主要包括细胞质囊泡腔、分泌颗粒管腔等；MF主要包括蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、醇基作为受体离子结合磷酸转移酶活性、激酶活性等，具体见图6。KEGG 信号通路富集分析，所得 179条信号通路，根据 LogP 值大小且与DCM有关的排名前10的通路为脂质和动脉粥样硬化、磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、MAPK信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、叉头转录因子（FoxO）信号通路等，其中，PI3K/AKT通路、MAPK通路、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）通路等与自噬密切相关，并能通过线粒体或雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等影响自噬[19-20]，具体见图7。上述结果提示丹参-黄芪可能通过多条信号通路调节自噬防治DCM。
2.5 分子对接结果及丹参-黄芪的中药核心成分-核心靶点-信号通路网络的构建
为进一步明确丹参-黄芪调节自噬防治DCM的关键靶点与活性成分之间的结合效能，将筛选后的核心靶基因与所有化学成分进行分子对接，通过Discovery Studio Client 19.1.0软件对其进行打分，以Lib Code Score值排名。Lib Code Score值≥120证明受体与配体具有较好的结合活性。分子对接结果表示SRC与丹酚酸J、黄芪异黄烷苷等具有较好的结合活性；GRB2与丹参酮IIB、丹参二醇A、丹参酮ⅡA等具有较好的结合活性；MAPK1与丹酚酸J、叶酸、黄芪异黄烷苷等具有较好的结合活性；EGFR与丹酚酸J、黄芪异黄烷苷等具有较好的结合活性；HRAS与丹参酮IIB，丹参二醇A等具有较好的结合活性；PIK3R1与叶酸具有较好的结合活性。选取各靶点与对接活性较好的活性成分，SRC与丹酚酸J、GRB2与丹参酮IIB、MAPK1与丹酚酸J、PIK3R1与叶酸、EGFR与丹酚酸J、HRAS与丹参酮IIB进行可视化分析，见图8。将丹参-黄芪对接后的活性成分15个、核心靶点6个、KEGG富集信号通路Top5导入微生信平台中绘制得到核心成分-靶点-信号通路网络，见图9。
2.6 lncRNA-miRNA-mRNA转录网络的构建
2.6.1 mRNA-miRNA网络构建与核心miRNA预测
将核心的6个mRNA导入Target Scan Human、miRDB及 miRTarBase数据库后，得到预测的miRNA。其中SRC有222个潜在miRNA，GRB2有316个潜在miRNA，MAPK1有729个潜在miRNA，PIK3R1有572个潜在miRNA，EGFR有460个潜在miRNA，HRAS有62个潜在miRNA。将核心mRNA与潜在miRNA导入Hubba插件中，用MCC、EPC、degree与closeness 4种算法分别筛选排名前14的关键miRNAs，分别构建mRNA-miRNA网络，见图10。将4种算法获得关键miRNA绘制韦恩图，预测核心miRNA共12个，依次为：miR-4731-5p、miR-503-5p、miR-641、miR-141-3p、miR-149-5p、miR-185-5p、miR-200a-3p、miR-448、miR-433-3p、miR-432-5p、miR-520g-3p、miR-599，见图11。
2.6.2 miRNA-lncRNA网络构建与核心lncRNA预测
将共有的12个核心miRNA导入StarBase数据库可以得到427个潜在lncRNA，其中miR-4731-5p预测到8个lncRNA，miR-503-5p预测到22个lncRNA，miR-641预测到34个lncRNA，miR-141-3p预测到32个lncRNA，miR-149-5p预测到51个lncRNA，miR-185-5p预测到59个lncRNA，miR-200a-3p预测到31个lncRNA，miR-448预测到23个lncRNA，miR-433-3p预测到28个lncRNA，miR-432-5p预测到51个lncRNA，miR-520g-3p预测到66个lncRNA，miR-599预测到22个lncRNA，去除重复后获得300个lncRNA。使用MCC、EPC、degree与closeness 4种算法筛选出排名前8位的关键lncRNA，见图12。将获得关键lncRNA绘制韦恩图，预测核心lncRNA共5个，依次为核富集丰富转录本1（NEAT1）、X-非活性特异性转录物（XIST）、肺腺癌转移相关转录本 1 （MALAT1）、MIR4435-2HG、BLACAT1，见图13。
2.6.3 lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络预测
将丹参-黄芪通过调节自噬防治DCM的6个核心mRNAs与12个核心miRNAs、5个核心lncRNAs导入微生信分析平台，绘制ceRNA网络，见图14。
3 讨论
自噬已被视为糖尿病患者心脏功能调节的关键因素[1]，丹参-黄芪药对用于DCM的治疗已有临床报道和文献支撑[21]。丹参活性成分具有保护心血管、抗心律失常、抗动脉粥样硬化、改善微循环、保护心肌等作用[11]；黄芪中黄芪多糖能调节心肌能量代谢、减轻糖尿病大鼠心肌组织损伤、抑制心肌细胞外基质积聚和心肌纤维化，恢复心肌功能等[22]。此外，丹参-黄芪水煎液可能通过激活腺苷酸活化蛋白激酶途径上调自噬，从而抑制异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌重构[21]。因此本研究认为丹参-黄芪药对可能通过调节自噬防治DCM。本研究通过网络药理学预测丹参-黄芪调节自噬防治DCM的主要活性成分为丹酚酸J、丹参酮IIB、黄芪异黄烷苷、丹参二醇A等。
基于网络药理学及生物信息学计算方法对丹参-黄芪活性成分调控自噬防治DCM的lncRNA-miRNA-mRNA转录网络预测中，获得核心mRNA为SRC、GRB2、MAPK1、PIK3R1、EGFR、HRAS。SRC是机体组织细胞凋亡、分化、迁移等多种生物学活性调控的信号通路分子[23]。研究[24]表明，肿瘤细胞中自噬可活化SRC，通过多种效应诱导蛋白激酶C、MAPK的活化，连接蛋白32等酪氨酸蛋白酶的磷酸化，阻止细胞间隙的连接通讯，进而阻断其对正常细胞的影响。肺组织中巨噬细胞自噬诱导的肺损伤炎症反应可通过磷酸化SRC来阻止[25]。GRB2是一种衔接蛋白，介导内皮生长因子受体、MAPK蛋白的信号传导[26]。急性心肌梗死患者心肌组织中GRB2通过诱导胶原蛋白合成导致心肌组织的重构[27]。研究[28-29]发现MAPK1通路活化，抑制血管内皮细胞mTOR介导自噬调节，诱发冠状动脉粥样硬化的发生。结肠癌细胞中EGFR的活化可通过介导MAPK1/3通路，激活自噬诱导肿瘤细胞死亡[30]。靶点HRAS可通过调节下游靶蛋白MAPK、PI3K等，参加肿瘤细胞自噬介导的细胞增殖、凋亡、代谢和血管生成[31]。因此，推测上述丹参-黄芪调节自噬防治DCM的核心靶点，可能通过彼此相互关联，以生物网络形式发挥调节作用。
有研究[1]发现，大多数的miRNA可以抑制DCM的自噬，从而对糖尿病心脏产生不同的影响。如miR30a/c、miR-133a和miR-551b-5p在糖尿病心脏中下调，当被激活后可抑制心脏自噬，减轻DCM[32-35]。本次研究筛选出的核心miRNA有miR-503-5p、miR-149-5p、miR-185-5p、miR-641等12个。其中miR-503-5p是前miR-503的5′末端[36]，miR-503高表达于DCM大鼠心脏组织中，其靶向负调控核因子红链烷2相关因子2的表达进而阻止心肌细胞免受氧化应激损伤[37]。miR-149-5p通过负调控其下游自噬相关靶标细胞ATG5参与细胞存活[38]。此外，miR-149-5p还可抑制白细胞介素6的表达，减少小鼠心肌缺血再灌注诱导的心肌凋亡[39]。研究[40]表明，lncRNA 是细胞自噬的调控因子，其可以通过多种机制影响自噬通路，一方面通过直接干扰自噬相关基因的表达和功能，另一方面充当ceRNA调节miRNA而影响下游基因的功能等机制调节自噬过程[3]。本研究预测了丹参-黄芪调节自噬防治DCM相关的核心lncRNA分别为NEAT1、XIST、MALAT1、MIR4435-2HG、BLACAT1。其中lncRNA NEAT1可以参与多种细胞内因子的调节[41]。有研究[42]表明，lncRNA NEAT1与自噬、癌细胞迁移侵袭等密切相关。肝细胞癌数据库筛选分析中发现，lncRNA NEAT1可能通过靶向结合miR-204，恢复自噬相关基因的表达水平，进而促进肝癌细胞自噬；此外，在癌症的相关研究中发现lncRNA NEAT1与本课题组筛选出的miR-185-5p 、miR-141-3p、miR-448等相互作用，参与癌细胞的迁移、侵袭与发展等[43-45]，但lncRNA NEAT1在DCM自噬调节机制中的作用尚不清楚。lncRNA XIST可通过与miRNA结合参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学过程[46-47]。MALAT1是基因间转录本，长约8 778 bp[48]。有研究[49]表明，lncRNA MALAT1能通过调控下游转录因子等来诱发细胞凋亡、炎症等病理变化，进而参与糖尿病及其并发症的发生与发展，其过表达会通过调节自噬增强小鼠心肌细胞的凋亡[50]。Sun等[51]发现lncRNA MALAT1可以与miR-200a-3p竞争结合，通过调节程序性死亡细胞4，调节缺氧诱导的小鼠心肌细胞的增殖、细胞周期进程和凋亡；沉默MALAT1，可增强心肌细胞活力，促进细胞周期进程并抑制细胞凋亡。此外lncRNA MALAT1还可靶向miR-141-3p促进高糖诱导的大鼠心肌细胞焦磷酸化，进而诱发炎症等病理症状[52]。可见，本研究预测出丹参-黄芪的核心miRNA与lncRNA可通过调节自噬、炎症反应、细胞凋亡、氧化应激损伤等过程参与DCM及多种疾病进程的调节。
KEGG富集分析结果发现PI3K/AKT信号通路、FoxO信号通路、AGE-RAGE 信号通路等是丹参-黄芪调节自噬防治DCM的核心通路。其中，PI3K/AKT信号通路在各种关键的细胞生理学和过程中起着核心作用，活化PI3K/AKT通路能改善线粒体功能障碍，拮抗心肌纤维化，抑制慢性炎症反应、心肌细胞凋亡、细胞自噬，延缓DCM发病进程[53]。
综上所述，本研究所构建的丹参-黄芪药对lncRNA-miRNA-mRNA转录网络可通过多靶点，多途径系统调节自噬防治DCM。基于网络药理学所获取的结果，可在一定程度上体现丹参-黄芪防治DCM的配伍用药特点，即从改善恢复人体生物网络平衡的整体观，辩证论治角度阐述药物与机体的相互作用，为探索丹参-黄芪药对调节自噬防治DCM作用机制提供理论参考。
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