目的  探讨甲氨蝶呤作用通路上6个相关基因SLCO1B1、SLC19A1、ABCC2、ABCB1、FPGS、GGH的单核苷酸多态性对原发性中枢神经系统淋巴瘤患者使用甲氨蝶呤化疗所致骨髓抑制不良反应的影响。

方法  采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对121例原发性中枢神经系统淋巴瘤患者的DNA样本进行基因分型。从电子病历系统获取患者的人口学及相应的临床资料，采用χ²检验及多因素Logistic回归分析探讨单核苷酸多态性对患者化疗后骨髓抑制的影响。

结果  121例患者共经历了508个疗程，其中186个疗程（36.6%）发生了骨髓抑制不良反应。单因素分析结果显示，SLCO1B1 rs2306283及GGH rs2305558位点的单核苷酸多态性对甲氨蝶呤所致骨髓抑制的发生率均有影响（P＜0.05）。Logistic回归分析显示，SLCO1B1 rs2306283位点单核苷酸多态性仍然对甲氨蝶呤所致骨髓抑制的发生率有影响[OR=1.542，95%CI（1.040，2.287），P=0.031]。

结论  SLCO1B1 rs2306283 GG基因型可作为甲氨蝶呤所致骨髓抑制的独立危险因素，为甲氨蝶呤的个体化给药提供依据。

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是一种叶酸拮抗剂，可通过抑制二氢叶酸还原酶发挥抗肿瘤作用[1]。目前，大剂量MTX（＞500 mg·m^-2）仍是原发性中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）的一线治疗方案[2]。体内，MTX通过溶质载体转运体19家族1（SLC19A1）或溶质载体有机阴离子转运体1B1家族（SLCO1B1）进入细胞。在胞浆中，叶酸聚谷氨酸合成酶（FPGS）和谷氨酰水解酶（GGH）可分别促进MTX的滞留及排泄。最后MTX在细胞内可由多药耐药蛋白（ABCBl）及多药耐药相关蛋白2（ABCC2）转运出胞。研究[3-4]发现，上述MTX作用通路上蛋白或酶的编码基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）可影响MTX的体内消除，进而影响胞内MTX的浓度，而MTX浓度被证明与疗效及不良反应相关。

目前，关于SNP对MTX不良反应的研究主要集中在亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR）。研究[5- 6]证实，MTHFR rs1801133基因多态性与MTX所致肝毒性、肾毒性与口腔黏膜炎相关。多项研究[7-8]发现MTHFR rs1801133基因多态性与MTX所致骨髓抑制亦有关。Han等[8]同时还发现MTHFR rs1801131基因多态性与MTX所致骨髓抑制相关。此外，在儿童成熟B细胞淋巴瘤患者中，SLCO1B1 rs11045879基因多态性也被证实与MTX所致骨髓抑制相关[5]。本研究旨在考察MTX作用通路上SLCO1B1、SLC19A1、ABCC2、ABCB1、FPGS、GGH等6个基因上的13个SNP对MTX所致骨髓抑制的影响，以探讨影响MTX骨髓抑制个体差异的遗传因素，为MTX的个体化用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

采用回顾性研究方法，选取2017年1月—2021年7月在复旦大学附属华山医院初诊为PCNSL的患者作为研究对象。本研究的执行符合《赫尔辛基宣言》及其补充条款，研究方案获得复旦大学附属华山医院伦理委员会审查通过（批件号：2021-974），由于本研究是回顾性研究，所有患者均已豁免知情同意。

纳入标准：①依据2016年世界卫生组织淋巴瘤分类标准[9]初诊为PCNSL；②性别不限，年龄＞18岁；③均接受以MTX单药或联合的治疗方案，MTX（澳大利亚辉瑞制药公司，规格：10 mL·g^-1，批号：AF6925、CY6728等）3.5~8 m^-2，ivd，3 h内完成；肝肾功能正常情况下，MTX的剂量为8 m^-2，否则，将根据肌酐清除率和总胆红素调整MTX的剂量，联用药物包括阿糖胞苷、多柔比星脂质体、依托泊苷、长春地辛、利妥昔单抗等。

排除标准：①人类免疫缺陷病毒阳性和免疫抑制相关的中枢神经系统淋巴瘤；②开始治疗前血小板计数（Plt）＜80×10⁹·L^-1和（或）血红蛋白（Hb）水平＜90 g·L^-1者。

1.2 骨髓抑制临床终点事件判定标准

化疗前未发生骨髓抑制时，骨髓抑制临床终点事件判定标准：①化疗后血小板减少，即Plt＜100×10⁹·L^-1；②化疗后中性粒细胞计数减少，即中性粒细胞计数＜2×10⁹·L^-1；③化疗后贫血，即Hb＜110 g·L^-1，上述3种情况发生其一，则认为患者发生了骨髓抑制[10]。

化疗前已经存在骨髓抑制时，需根据不同情况判定MTX致骨髓抑制临床终点事件。若化疗前和化疗后的骨髓抑制分级相同，则认为患者未发生骨髓抑制；若化疗后骨髓抑制程度加重，如由Ⅰ级骨髓抑制加重为Ⅱ级骨髓抑制，则认为患者发生了骨髓抑制。骨髓抑制分级标准采用常见不良事件评价标准（Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE）5.0版[10]，具体的分级标准包括：①Plt减少，1级[（75~100）×10⁹·L^-1]、2级[（50~75）×10⁹·L^-1]、3级[（25~50）×10⁹·L^-1]、4级（＜25×10⁹·L^-1）；②中性粒细胞计数减少，1级[（1.5~2）×10⁹·L^-1]、2级[（1.0~1.5）×10⁹·L^-1]、3级[（0.5~1.0）×10⁹·L^-1]、4级（＜0.5×10⁹·L^-1）；③Hb减少：1级（100~110 g·L^-1）、2级（80~100 g·L^-1）、3级（＜80 g·L^-1；需要输血治疗）、4级（危及生命；需要紧急治疗）。

1.3 基因型分析

取2 mL患者血样，使用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物科技公司，货号：DP318）参照说明书进行抽提。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对MTX作用通路上6个基因的13个位点进行基因分型。

主要实验流程包括：聚合酶链式反应扩增目标基因片段，单碱基延伸反应，产物纯化后采用Nanodispenser SpectroCHIP芯片点样，并使用MassARRAY Analyzer Compac质谱检测，最后采用TYPER 4.0软件分析实验结果，获得分型数据。

1.4 统计学分析

使用Microsoft Excel 2020软件录入数据，采用SPSS 26.0软件进行统计分析。等位基因及基因型频率采用SHEsis在线软件（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）进行计算。Hardy-Weinberg平衡检验采用Pearson χ²检验。计量资料的正态性采用Kolmogorov-Smirnov检验；符合正态分布的计量资料采用x±s表示，两组比较采用独立样本t检验。计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ²检验。用χ²检验考察SNP对化疗后骨髓抑制的影响；采用多因素Logistic回归模型分析纳入临床及人口学因素等协变量后基因型对骨髓抑制的影响。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

最终选取121例以大剂量MTX使用为基础化疗方案的PCNSL患者。其中，男性80 例（66.1%），女性41 例（33.9%），患者平均年龄（57.5±12.1）岁，身高（167.6±7.8）cm，体重（64.7±10.5）kg。Hb、MTX单位体表面积剂量对骨髓抑制存在影响（P＜0.01），见表1。

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  表格1 121例（508个疗程）原发性中枢神经系统淋巴瘤患者化疗前的临床特征[n(%),x±s]

  Table 1.Clinical features of 121 patients (508 treatment courses) with primary central nervous system lymphoma before chemotherapy [n(%),x±s]

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121例PCNSL患者使用MTX进行化疗，共进行了508个疗程。186个化疗疗程（36.6%）后发生了骨髓抑制不良反应，其中30个疗程后发生中性粒细胞减少，59个疗程后发生血小板减少，150个疗程后发生贫血。82个疗程（16.1%）后发生了2级及以上不良反应，其中15个疗程后发生中性粒细胞减少，35个疗程后发生血小板减少，56个疗程后发生贫血，见表2。

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  表格2 121例（508个疗程）原发性中枢神经系统淋巴瘤患者的骨髓抑制不良事件[n，n（%）]

  Table 2.Adverse events in 121 patients (508 treatment courses) with primary central nervous system lymphoma [n, n(%)]

  注：a中性粒细胞减少、血小板减少、贫血等3个事件只要发生其一则认为患者发生骨髓抑制

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2.2 基因型与位点频率分布

共检测了MTX作用通路上6个基因包括SLCO1B1、SLC19A1、ABCC2、ABCB1、FPGS、GGH上的共13个位点的基因型。该13个SNP位点在染色体的分布及等位基因频率信息见表3。所有位点的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

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  表格3 13个单核苷酸多态性位点在染色体的分布及等位基因频率

  Table 3.Distribution of 13 single nucleotide polymorphic loci in chromosomes and allele frequencies

  注：aHardy-Weinberg平衡检验；b本研究中该等位基因的最小等位基因频率；cHAPMAP数据库中我国汉族人群该等位基因的最小等位基因频率

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2.3 SNP对MTX导致骨髓抑制的影响

由于存在某种基因型患者人数较少的情况，为便于统计，本研究对各位点的基因型分别进行了如下合并：将纯合子次要等位基因型和杂合子等位基因型归为一类，将纯合子主要等位基因型归为一类。单因素分析结果显示，SLCO1B1 rs2306283与GGH rs2305558位点的SNP均对患者使用MTX后骨髓抑制的发生率存在影响（P＜0.05），见表4。

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  表格4 121例（508个疗程）PCNSL患者中单核苷酸多态性对骨髓抑制不良反应影响的单因素分析 [n（%）]

  Table 4.Univariate analysis of gene polymorphisms on MTX-induced myelosuppression in 121 patients with PCNSL (508 treatment courses) [n(%)]

  注：a前一个碱基是指低频率等位基因，后者是指高频率等位基因；b“11、12、22”中的1、2是指每个SNP的低频率等位基因和高频率等位基因；c对于具有3个SNPs G/T/A的rs2032582，11+12为含有G等位基因的单倍型，22为仅含有A或T等位基因的单倍型

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将单因素分析结果P＜0.1的变量（MTX单位体表面积剂量、化疗前血小板计数是否正常、化疗前Hb是否正常）及年龄、性别等协变量同SLCO1B1 rs2306283和GGH rs2305558基因型共同纳入多因素Logistic回归模型。结果发现，SLCO1B1 rs2306283位点的SNP仍然对甲氨蝶呤所致骨髓抑制的发生率有影响，SLCO1B1 rs2306283 GG基因型的PCNSL患者使用MTX后发生骨髓抑制的风险是A等位基因携带者的1.542倍[95%CI（1.040，2.287），P=0.031]。除此之外，未发现其他SNP对患者使用MTX后是否发生骨髓抑制存在影响。并且本研究发现，年龄、性别这两个人口学因素对患者使用MTX后是否发生骨髓抑制也存在影响（P=0.001，P=0.020）。见表5。

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  表格5 121例PCNSL患者（508个疗程）中单核苷酸多态性对骨髓抑制不良反应影响的Logistic回归分析

  Table 5.Logistic regression analysis of gene polymorphisms on MTX myelosuppression

  in 121 patients with PCNSL (508 treatment courses)

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3 讨论

本研究通过探讨PCNSL患者中，MTX作用通路上基因的SNP与MTX化疗所致骨髓抑制的相关性，试图寻找引起化疗后骨髓抑制毒性发生与否的遗传因素，便于临床医师对患者进行个体化给药。

本研究共纳入了13个MTX作用通路相关的基因多态性，分别位于SLCO1B1、SLC19A1、ABCC2、ABCB1、FPGS、GGH等基因。研究结果显示，SLCO1B1 rs2306283基因型可作为判断化疗后骨髓抑制发生与否的独立标志物，具有SLCO1B1 rs2306283 GG基因型的患者使用MTX后发生骨髓抑制的风险是A等位基因携带者的1.542倍。

SLCO1B1 rs2306283位于基因的外显子区，外显子发生突变后会造成编码区氨基酸组成的变化，从而使基因结构或表达发生变化，进而对基因功能产生影响[11]。关于SLCO1B1 rs2306283基因多态性对疾病的影响，Shahrure等[12]研究发现，SLCO1B1 rs2306283基因多态性是约旦糖尿病患者发生他汀类药物诱导的肌病的危险因素。Liuykeviciene等[13]研究SLCO1B1 rs2306283基因多态性对早期渗出性年龄相关性黄斑变性患者的影响，然而并未发现该SNP与渗出性年龄相关性黄斑变性具有相关性。以上研究提示不同的疾病中SLCO1B1 rs2306283的作用也不尽相同。本研究中，由于SLCO1B1 rs2306283 A＞G的基因突变是一种错义突变，推测因编码氨基酸的密码子经碱基替换后导致多肽链的氨基酸种类和序列发生改变，SLCO1B1基因表达改变，最终导致细胞内MTX浓度升高，使造血干细胞分化为髓系祖细胞及成熟血细胞的过程受抑制，破坏了骨髓内血细胞的增殖、成熟和释放与外周血细胞的衰老死亡、破坏和排出的平衡，出现红细胞、粒细胞和血小板减少的情况，从而导致骨髓抑制[14]。

MTX引起骨髓抑制的同时，其他化疗药物如阿糖胞苷、长春地辛等也可以引起骨髓抑制。Salamoon等[15]研究发现，同时使用大剂量阿糖胞苷的PCNSL患者更易发生4级骨髓抑制；本课题组[16]研究发现，MTX联用长春地辛亦可加重骨髓抑制。然而，本研究仅对MTX单用、联用化疗或靶向药等不同的治疗方案所致骨髓抑制存在的影响进行考察，且并未发现上述3种MTX化疗方式对骨髓抑制存在影响。考虑到临床化疗联合用药的多样性及样本量的局限性，本研究未具体分析联用不同的化疗药对骨髓抑制的影响。这是本研究的一个局限，收集化疗方案更加统一的患者进行分析将是未来研究的重点。

总之，本研究发现SLCO1B1 rs2306283位点SNP对甲氨蝶呤所致骨髓抑制的发生率有影响，但这一研究结果可否应用到临床，尚需要多中心、更大样本的研究来验证。

1.Kanderi T, Chan Gomez J, Puthenpura MM, et al. Pancytopenia as a complication of low-dose methotrexate in a septuagenarian: a rare presentation[J]. Cureus, 2020, 12(6): e8492. DOI: 10.7759/cureus.8492.

2.王振华, 袁燕, 吴婷, 等. 安全使用大剂量甲氨蝶呤治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤1例分析[J]. 上海医药, 2021, 42(15): 3-4，64. [Wang ZH, Yuan Y, Wu T, et al. Safe administration of high-dose methotrexate in treatment of a patient with primary central nervous system lymphoma[J]. Shanghai Medical & Pharmaceutical Journal, 2021, 42(15): 3-4, 64.] DOI: 10.3969/j.issn.1006-1533. 2021.15.002.

3.Fox E, Busch C, Debernardo A, et al. A pharmacologically-based approach to high dose methotrexate administration to investigate nephrotoxicity and acute kidney injury biomarkers in children and adolescents with newly diagnosed osteosarcoma[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2021, 87(6): 807-815. DOI: 10.1007/s00280-021-04248-8.

4.Lui G, Treluyer JM, Fresneau B, et al. A pharmacokinetic and pharmacogenetic analysis of osteosarcoma patients treated with high-dose methotrexate: data from the OS2006/Sarcoma-09 trial[J]. J Clin Pharmacol, 2018, 58(12): 1541-1549. DOI: 10.1002/jcph.1252.

5.Huang S, Jin L, Yang J, et al. Study on relationships of tumor status and gene polymorphism with blood concentration of mtx and toxicities in 63 pediatric mature B cell lymphoma in Chinese population[J]. Technol Cancer Res Treat, 2021, 20: 1533033821995288. DOI: 10.1177/1533033821995288.

6.Chang X, Guo Y, Su L, et al. Influence of MTHFR C677T polymorphism on high-dose methotrexate-related toxicity in patients with primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2021, 21(2): 91-96. DOI: 10.1016/j.clml.2020.08.020.

7.Choi YJ, Park H, Lee JS, et al. Methotrexate elimination and toxicity: MTHFR 677C>T polymorphism in patients with primary CNS lymphoma treated with high-dose methotrexate[J]. Hematol Oncol, 2017, 35(4): 504-509. DOI: 10.1002/hon.2363

8.Han J, Liu L, Meng L, et al. Effect of polymorphisms of ABCB1 and MTHFR on methotrexate-related toxicities in adults with hematological malignancies[J]. Front Oncol, 2021, 11: 759805.DOI: 10.3389/fonc.2021.759805.

9.Swerdlow SH, Campo E, Pileri SA, et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms[J]. Blood, 2016, 127(20): 2375-2390. DOI: 10.1182/blood-2016-01-643569.

10.National Institutes of Health, National Cancer Institute. Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v 5.0. 2017[EB/OL]. (2017)[2021-07-01]. https://ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7.pdf.

11.Bruno A, Boisselier B, Labreche K, et al. Mutational analysis of primary central nervous system lymphoma[J]. Oncotarget, 2014, 5(13): 5065-5075. DOI: 10.18632/oncotarget.2080.

12.Shahrure ZM, Irshaid YM, Mustafa KN, et al. SLCO1B1 gene polymorphisms (rs2306283 and rs4149056) and statin-induced myopathy in jordanian diabetics[J]. Curr Rev Clin Exp Pharmacol, 2021, 16(3): 281-288. DOI: 10.2174/1574884715666200827105612.

13.Liuykeviciene R, Vilkeviciute A, Slavinskaite A, et al. Evaluation of serum SLCO1B1 levels and genetic variants of SLCO1B1 rs4149056 and rs2306283 in patients with early and exudative age-related macular degeneration[J]. Gene, 2018, 676: 139-145. DOI: 10.1016/j.gene.2018.07.031.

14.Gonzalez-ibarra F, Eivaz-mohammadi S, Surapaneni S, et al. Methotrexate induced pancytopenia[J]. Case Rep Rheumatol, 2014, 2014: 679580.DOI: 10.1155/2014/679580.

15.Salamoon M, Hussein T, Kenj M, et al. High-dose methotrexate, high-dose cytarabine and temozolomide for the treatment of primary central nervous system lymphoma (PCNSL)[J]. Med Oncol, 2013, 30(4): 690. DOI: 10.1007/s12032-013-0690-9.

16.Sun K, Tao HW, Ding TL, et al. Risk factors for high-dose methotrexate associated toxicities in patients with primary central nervous system lymphoma[J]. J Clin Pharm Ther, 2022, 47(12): 2196-204.