目的  开发一种简单灵敏的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）用于人血清中多黏菌素B（PB）的浓度测定。

方法  用多黏菌素E₂（PE₂）作为内标，使用乙腈（含0.1%甲酸）沉淀蛋白质法处理样品。采用Hypersil GOLD™ C₁₈色谱柱进行色谱分析。流动相A为0.1%甲酸-水，流动相B为纯甲醇，梯度洗脱；流速：0.4 mL·min^-1，进样量：2 μL，分析时间：3.3 min，柱温：40℃。采用多反应监测模式，电喷雾离子源正离子模式进行定量分析。定量离子对分别为m/z 402.10＞101.10（PB₁），m/z 397.45＞101.10（PB₂），m/z 578.50＞101.10（PE₂）。

结果  人血清中PB₁在22~15 000 ng·mL^-1，PB₂在5~1 700 ng·mL^-1范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 0。PB₁和PB₂的定量下限分别为22，5 ng·mL^-1。PB₁的准确度为95.98%~104.60%，PB₂的准确度为98.11%~105.59%；批内和批间精密度的RSD均小于15%。PB₁和PB₂ 的提取回收率分别为97.26%~103.31%和95.81%~101.22%；基质效应分别为96.52%~109.54%和93.29%~109.95%。样品稳定性试验的RSD均小于15%。应用本方法测定的6例患者平均AUC_0-24h为（72.85±17.87）mg·h·L^-1。

结论  建立的测定人血清中PB浓度的LC-MS/MS方法符合生物样本检测分析的要求，适用于临床上PB血药浓度检测。

多黏菌素B（polymyxin B, PB）是一种由环七肽和三肽侧链组成的抗生素，用于治疗革兰阴性细菌引起的感染[1]。PB易诱导以急性肾损伤和急性肾小管坏死为特征的肾毒性以及以感觉异常和呼吸抑制为特征的神经毒性[2]，因此20世纪60年代后，临床逐渐减少使用[3]。但自20世纪90年代以来，随着耐多药的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌引起的感染日益流行，在缺乏针对这些耐多药革兰阴性菌的新型抗菌药的情况下，PB作为最后一道防线被重新启用[4]，是耐多药革兰阴性菌引起感染的最后治疗方案之一[5]。

PB虽很早被发现，但由于没有经过现代药物的开发程序，其在人体中的药动学特征还没有完全定论[6]。而血清中总的PB水平是决定临床疗效和毒性的重要因素[7]。为了达到疗效同时避免毒性，多个国际机构和学术组织联合发布的国际共识指南[2]，推荐PB在稳态下24 h的血药浓度-时间曲线下面积（AUC_{SS, 0~24h}）为50~100 mg·h·L^-1，相当于药物的目标平均血药稳态浓度（C_{SS, avg}）为2~4 mg·L^-1 。若超过这个范围，会显著增加急性肾损伤的发生和严重程度。因此有必要在使用PB治疗时进行严格的药物浓度监测[8]。PB的主要成分是多黏菌素B₁（polymyxin B₁, PB₁）和多黏菌素B₂（polymyxin B₂, PB₂），约占整体含量的85%[9]。PB浓度监测主要侧重于对这两种主要成分浓度的测定。目前PB的分析方法包括微生物学、高效液相色谱（HPLC）法、液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法、薄层色谱（TLC）法和免疫分析方法等，每种方法都具有不同的灵敏度和适用性，但根据PB治疗药物监测专家共识[10]推荐，LC-MS/MS是最合适的方法。过去开发的分析方法多侧重于传统的生物分析，随着技术的发展，目前的PB定量方法倾向于将液相色谱与质谱相结合[11]。但目前已有的LC-MS/MS方法存在检测范围受限、耗时较长、忽略高浓度PB残留等问题。为了更好地满足临床需求，本研究基于LC-MS/MS进行优化，建立了一种更快速、灵敏、简单的测定人血中PB浓度的方法，便于临床进行PB血药浓度监测及药动学研究，优化给药方案，实现合理用药。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LCMS-8050CL三重四极杆质谱仪系统（日本岛津公司）；TGL^-16低温台式离心机、L530离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Clever-S超纯水机[芷昂仪器（上海）有限公司]；KQ5200E型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；AUW12D电子分析天平（日本岛津公司）；MIX-2500迷你混匀仪（上海启前电子科技有限公司）。

1.2 试药

PB标准品（加拿大TRC公司，纯度：95%；PB₁含量73.4%，PB₂含量9%, 批号：19-JPO-184-1）；多黏菌素E₂标准品（polymyxin E₂，PE₂，法国LGC公司，批号：1087078，纯度89.0%)；甲醇（色谱纯，Thermo公司，批号：22045156）；乙腈（Thermo公司，色谱纯，批号：22035335）；甲酸（迈瑞尔公司，色谱纯，批号：70767118）。超纯水由Clever-S超纯水机制得。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

LC-MS/MS分析在LCMS-8050CL系统上进行（日本岛津公司）。色谱柱为Hypersil GOLD™ C₁₈ （30 mm×2.1 mm, 3 μm），柱温：40℃；取2 μL样品注入LC30A UPLC系统。流动相A为0.1%甲酸-水，流动相B为纯甲醇；以0.4 mL·min^-1的流速进行梯度洗脱：10%B（0.1 min）→50%B（0.3 min）→100%B（0.5 min）→100%B（1.0 min）→50%B（1.5 min）→10%B（1.7 min）；分析时间为3.3 min。采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）模式进行定量分析。各离子通道和相应的碰撞电压如下：PB₁：m/z 402.10＞101.10，碰撞电压-31 V；PB₂：m/ z 397.45＞101.10，碰撞电压-26 V；PE₂：m/ z 578.50＞101.10，碰撞电压-30 V。样品分析采用以下接口设置:雾化气流量3 L·min^-1，加热气流量10 L·min^-1，干燥气流量10 L·min^-1，接口温度300℃，DL温度250℃，蒸发器温度400℃。接口电压为4.0 kV，检测器电压为1.94 kV。

2.2 标准溶液和质控溶液的配制

精密称取适量PB溶于超纯水中配制成浓度为1 mg·mL^-1的储备液。取适量储备液用超纯水稀释成PB₁浓度为220，2 200，6 800，17 000，36 000，74 000，150 000 ng·mL^-1和PB₂浓度为50，240，780，2 000，4 000，8 500，17 000 ng·mL^-1的标准储备液。-80℃储存备用。

取适量浓度为1 mg·mL^-1的储备液用超纯水稀释成PB₁浓度为600，29 000，120 000 ng·mL^-1和PB₂浓度为150，3 300，14 000 ng·mL^-1的质控储备液。-80 ℃储存备用。

吸取20 μL标准储备液于聚丙烯管中，加入180 μL空白血清，振荡1 min，配制成含PB₁浓度分别为22，220，680，1 700，3 600，7 400，15 000 ng·mL^-1和含PB₂浓度分别为5，24，78，200，400，850，1 700 ng·mL^-1的标准曲线样品。对于质控储备液进行同样的操作配制成含PB₁浓度分别为60，2 900，12 000 ng·mL^-1和含PB₂浓度分别为15，330，1 400 ng·mL^-1的质控样品。

2.3 内标溶液的配置

精密称取PE₂适量溶于水中配制成浓度为1 mg·mL^-1的储备液。取储备液适量用水稀释成50 μg·mL^-1的内标溶液。-80 ℃存储备用。

2.4 血清采集

本研究已通过武汉大学中南医院伦理委员会批准（伦理批件号：临研伦[2022084]），所有受试者均已签署知情同意书。血液样本取自武汉大学中南医院的健康志愿者（未用药，空白血液）和由于革兰阴性菌感染而使用PB治疗的重症患者，采集于分离胶促凝管中，离心（1 940×g）10 min后，取上清液-80 ℃保存待分析。

2.5 血清样品处理

精密吸取40 μL血清于1.5 mL的聚丙烯管中，再加入10 μL内标溶液，最后加入120 μL乙腈 （0.1%甲酸）进行蛋白沉淀。振荡1 min后低温离心机离心（20 120 ×g，4℃）8 min，吸取150 μL上清液加入96孔板中，再离心（2 200 ×g）1 min，上机进行分析，每次进样2 μL。

2.6 方法学验证

2.6.1 标准曲线和定量下限

将“2.2”项下制备的PB₁和PB₂标准曲线样品按照“2.5”项下方法进行处理后上机分析。以浓度为横坐标，面积比为纵坐标，应用加权（W=1/X²）最小二乘法进行线性回归分析，拟合的PB₁和PB₂标准曲线方程分别为Y= 5.847×10^{- 4}X-8.115×10^-2（r=0.999 8），Y= 1.223×10^{- 3}X+4.958×10^-2（r=0.999 1），表明PB₁和PB₂在标准曲线浓度范围内线性良好。

定量下限通过信噪比（S/N）确定。当S/N≥3时为检测限，当S/N≥10时可作为定量下限。PB₁和PB₂的定量下限分别为22（21.76± 2.69） ng·mL^-1和5（5.23±0.54）ng·mL^-1。

2.6.2 准确性与精密度

按照“2.2”项下方法配制低、中、高三个等级浓度的质控样品，每个浓度的样品平行配制6份，再按照“2.5”项下方法处理后上机检测。连续测定3 d，考察批内、批间准确度（测得值/理论值×100%）和精密度（标准差/测得值均值×100%）。结果PB₁的批内和批间准确度为95.98%~104.60%；PB₂的批内和批间准确度为98.11%~105.59%。见表1。批内和批间的精密度（RSD）应均小于15%，准确度均值应在±15%之间才符合生物定量分析指导原则。

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  表格1 PB1和PB2的批内、批间准确度及精密度

  Table 1.Intra- and inter-day accuracy and precision of PB1 and PB2

  

2.6.3 提取回收率和基质效应

取“2.2”项下制备的PB₁和PB₂低、中、高浓度的质控样品，每个浓度平行取6份，按照“2.5”项下方法对样品进行处理后上机分析，得到PB₁的峰面积A₁和PB₂的峰面积B₁。另取不含待测物质的空白血清，用乙腈（含0.1%甲酸）进行蛋白质沉淀，之后取上清液于聚丙烯管中，再加入“2.2”项下制备的PB₁和PB₂的质控储备液，配制成PB₁浓度分别为60，2 900，12 000 ng·mL^-1和PB₂浓度分别为15，330，1 400 ng·mL^-1的样品，再向样品中加入10 μL内标溶液，每个浓度的样品平行配制6份，振荡后上机测试。分析得到PB₁的峰面积A₂和PB₂的峰面积B₂。将不含待测物质的空白血清替换成超纯水，其余按照A₂和B₂对应的样品处理方法进行操作，得到PB₁和PB₂的峰面积A₃和B₃。A₁/A₂和B₁/B₂分别为PB₁和PB₂的提取回收率，A₂/A₃和B₂/B₃分别为PB₁和PB₂的基质效应。结果PB₁和PB₂的提取回收率分别为97.26%~103.31%和95.81%~101.22%；基质效应分别为96.52%~109.54%和93.29%~109.95%。见表2。提取回收率和基质效应RSD均应小于15%才表明该方法符合生物样本分析要求。

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  表格2 PB1和PB2的提取回收率和基质效应（n=6）

  Table 2.Extraction recovery and matrix effect of PB1 and PB2 (n=6)

  

2.6.4 专属性试验

测定6份不同来源的空白血清（不含待测物质，不加内标）、定量下限的血清样品以及重症患者给药后30 min的血清样品来评估方法的专属性。各血清样品均按照“2.5”项下方法进行处理，结果见图1。PB₁的保留时间约为1.75 min，PB₂的保留时间约为1.67 min，内标PE₂的保留时间约为1.62 min。各成分在保留时间内峰型良好，无杂峰干扰，表明血清内源性物质没有对待测成分产生干扰，方法专属性良好。

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  图1 PB1、PB2、PE2色谱图

  Figure 1.Chromatograms of PB1, PB2, and PE2

  

2.6.5 稳定性试验

取“2.2”项下制备的PB₁和PB₂的质控样品，每个浓度6份，按照“2.5”项下方法处理后进样分析。考察样品在室温下放置8 h、自动进样器4℃放置48 h、-80℃反复冻融3次以及-80℃下放置30 d的稳定性。结果如表3所示。在以上条件下的血清样品经检测，RSD范围为0.91%~11.02%（n=6），表明样品稳定性良好。

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  表格3 PB1和PB2在不同条件下的稳定性结果（x±s, n=6）

  Table 3.Stability results of PB1 and PB2 under different conditions (x±s, n=6)

  

2.6.6 残留性检测

将“2.2”项下制备的定量上限样品（PB₁：15 000 ng·mL^-1，PB₂：1 700 ng·mL^-1）和定量下限样品（PB₁：22 ng·mL^-1，PB₂：5 ng·mL^-1），按“2.5”项下方法进行处理后上机分析。在进样1针定量上限样品后连续进样空白样品进行评估。结果进样3针空白样品后，残留峰面积均小于定量下限峰面积的20%和内标峰面积的5%（PB₁：7.02%, PB₂：6.26%, PE₂：0.15%），符合生物分析指导原则。为不影响准确度和精密度，在测试样品之间额外增加空白样品的进样数量。

2.6.7 稀释可靠性

为了确保稀释不影响结果的准确度和精密度，分别配制浓度为50 000，3 000 ng·mL^-1的PB₁和PB₂溶液，按照1 ∶ 9的比例用空白血清稀释，按照“2.5”项下方法处理后进样分析。结果PB₁和PB₂的测得值分别为（5 197.36±293.49）ng·mL^-1和（307.19±23.81）ng·mL^-1，RSD分别为5.65%和7.75%（n=6）。PB₁和PB₂的准确度和精密度均在±15%之间，提示稀释对结果未产生影响。

2.7 临床应用

选取6例革兰阴性菌感染并使用PB（上海上药第一生化药业有限公司，规格：50万单位，批号：2309803）治疗的重症患者，给药剂量均为75万单位，ivd，q12h，分别在血药浓度达到稳态后的下一次给药前30 min、滴注完毕、给药后0.5，1，2，4，8，12 h进行采样。按照“2.4”“2.5”项下方法对血样进行处理后，应用已通过验证的方法进行血药浓度测定。结果PB半衰期为（9.33±7.62）h，分布容积为（21.58±16.67）L，清除率为（2.06±5.02）L·h^-1，平均AUC0-24h为（72.85±17.87）mg·h·L^-1。PB₁和PB₂血药浓度范围分别为323.89~5 971.78 ng·mL^-1和24.58~ 807.91 ng·mL^-1。所建立的方法能够满足患者血清中PB浓度检测要求。根据血药浓度结果，建议将下一次给药前作为谷浓度采样点，静滴完毕后作为峰浓度采样点。

3 讨论

3.1 色谱条件选择

不同的色谱柱对PB的分离效果不同。在试验初期尝试了Waters ACQUITY UPLC C₈（50 mm×2.1 mm, 1.7 μm），发现在低浓度时峰型较差，存在严重的拖尾现象。进一步考察了Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈（2.1mm× 50 mm, 1.8 μm）、Agilent ZORBAX Hilic Plus（2.1 mm×50 mm, 1.8 μm）、Agilent UHPLC Guard 3PK（2.1 mm×5 mm, 1.8 μm）和Hypersil GOLD™ C₁₈（30 mm×2.1 mm, 3 μm），最终发现Hypersil GOLD™ C₁₈相对于其他色谱柱峰型更加对称且无杂峰，保留时间也更加合适。在色谱分离方面，流动相的选择也至关重要。首先对水相中甲酸的比例进行了调整（0.1%~0.5%），通过调节水相pH对峰型有一定改善作用[12]。但由于原本峰型良好，无需做较大改变，且酸性过强会影响仪器使用寿命，因此最后选择0.1%甲酸-水作为水相。对于有机相的选择，考察了纯甲醇、纯乙腈和甲醇:乙腈（1 ∶ 1, v/v），发现以纯甲醇作为有机相时得到的峰型对称且没有拖尾。

3.2 内标选择

查阅文献[6,13-15]发现在检测时能作为内标使用的包括PE1、纤维蛋白肽B、异亮氨酸-PB₁、PB₁-1和PE₂等，其中最常用的是PE₂。因此选取了与PB结构相似的PE₂作为内标，其能很好地降低基质效应和减少对待测物质的干扰[16]。处理蛋白的常见方法包括固相萃取法、三氟乙酸去除法和有机溶剂沉淀法[13,17-18]。综合考虑后选取了成本低、操作简单的有机溶剂沉淀法。由于PB在酸性环境中比较稳定，因此考察了0.1%的甲酸在纯甲醇、纯乙腈以及不同比例的甲醇乙腈中的提取效果，发现0.1%甲酸-乙腈作为沉淀剂效果更好。

3.3 质谱条件选择

PB₁、PB₂和PE₂均在正离子模式下响应较好。本研究通过前体离子扫描和产物离子扫描确定了强度较高的离子对，再通过设置不同碰撞电压选出了以下离子对：PB₁：m/z 402.10＞101.10，-31 V；m/z 402.10＞120.15，-47 V。PB₂：m/z 397.45＞101.10，-26 V；m/z 397.45＞74.10，-50 V。PE₂：m/z 578.50＞101.10，-30 V；m/z 578.50＞227.2，-30 V。采用其中强度最高的离子对进行定量。各个化合物的离子对分别是PB₁：m/z 402.10＞101.10，-31 V；PB₂：m/z 397.45＞101.10，-26 V；PE₂：m/z 578.50＞101.10，-30 V。

3.4 临床应用

PB基本结构是由一个聚阳离子肽环和一个通过酰胺键连接在肽环上的脂肪酸侧链组成[19]。这种结构使其同时具有亲水和亲脂性，能够很好地分布于水和非水环境中，因此极易溶于水（或血液）以及原核和真核脂质膜[20]。PB的T_1/2为9~11.5 h[21]，在健康个体中的CL为2.922 L·h^-1，V为12.4 L[22]。PB在危重患者中CL为0.460~0.504 mL·min^-1·kg^-1，V为0.14~ 0.33 L·kg^-1 [23]。与一般患者相比，危重症患者的分布容积显著增加，因此需要更大的剂量才能在感染部位达到最佳药物浓度[23]。本研究中患者达到AUC0~24h目标[2]的比例是83.33%。由于危重症患者个体差异大，按照说明书统一剂量经验给药可能会导致部分患者疗效未达标。另外对于危重症患者常需要体外器官支持，如采用持续肾脏替代治疗或血液透析，这可能会导致相对分子质量较小、低蛋白结合和亲水性的药物清除增加[24]。而且危重症患者治疗方案常与其他抗菌药物联用，可能存在药物相互作用影响疗效。因此，应通过对危重症患者开展PB血药浓度监测进行剂量或给药频次调整，实现个性化给药。

3.5 小结

本研究建立的LC-MS/MS法经过全面验证，与现有方法相比有以下优点：①应用新的高强度离子对，检测范围增大，提高了检测灵敏度（PB₁：22 ng·mL^-1，PB₂：5 ng·mL^-1），能覆盖更宽的浓度检测范围，进一步增强临床血药浓度监测能力；②采用乙腈结合甲酸溶液沉淀蛋白，操作简单快速，减少对色谱柱的损害，降低成本，提升沉淀效果；③通过改变流动相组成，调整洗脱程序，将分析时间缩短至3.3 min，满足大量样本检测需求；④PE₂作为内标，与待测物的化学性质、保留时间、 碰撞压力等均相近，很好地消除了基质效应，增强离子化效率；⑤增加空白洗脱，避免高浓度PB残留影响；⑥方法可重复性高，结果稳定性和准确性高。综上所述，本研究建立的LC-MS/MS方法具有高灵敏度、高特异性、简单、快速等优点，满足临床检测要求，适用于PB血药浓度监测及药动学研究。

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