目的  探讨木犀草素对急性肾损伤的保护作用。

方法  通过脂多糖（LPS）构建小鼠内毒素性所致的急性肾损伤模型，使用木犀草素对肾损伤小鼠进行治疗；给小鼠尾静脉注射miR-30c-5p antagomir以敲低miR-30c-5p的表达。动物分组如下：正常对照组、LPS组、木犀草素治疗组（LPS+Lu组）、木犀草素治疗的阴性对照组（LPS+DMSO组）、miR-30c-5p表达敲低组（antagomir 30c-5p组）、miR-30c-5p表达敲低对照组（antagomir NC组）。采用自动化学分析仪测定小鼠血清肌酐和尿素氮水平，通过HE染色观察肾组织病理损伤。采用ELISA试剂盒检测小鼠血清胱抑素C（Cys-C）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-4水平，通过TUNEL染色和Western blot检测细胞凋亡。

结果  与正常对照组相比，LPS组小鼠急性肾损伤病理情况严重，血清肌酐、尿素氮和Cys-C、促炎因子IL-6、TNF-α、促凋亡因子B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）的表达水平显著升高（P＜0.05），而抗炎因子IL-4、抗凋亡因子Bcl-2、miR-30c-5p水平显著下降（P＜0.05）。与LPS组相比，LPS+Lu组肾损伤病理情况减轻，血清肌酐、尿素氮和Cys-C、IL-6、TNF-α、Bax的表达水平显著降低，而IL-4、Bcl-2、miR-30c-5p水平显著上升（P＜0.05）。与antagomir NC组小鼠相比，antagomir 30c-5p组小鼠促炎因子水平及细胞凋亡率显著上升（P＜0.05）。

结论  木犀草素通过上调miR-30c-5p表达抑制炎症和细胞凋亡从而保护急性肾损伤小鼠。

急性肾损伤是败血症的常见合并症，与危重患者死亡率增加相关[1-2]。脓毒症相关肾损伤患者的标准治疗包括快速使用抗菌药物和通过充分的液体复苏或使用血管加压药来避免低血压，然而由于目前的治疗存在局限性，开发旨在安全有效控制脓毒症相关急性肾损伤的新型药物将为预防严重疾病提供更有希望的治疗方法。在脓毒症期间，病原体相关分子模式被释放到血液循环中[3]，其中，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是一种由革兰阴性菌产生的内毒素。这种炎症介质通过与 Toll 样受体相互作用刺激许多不同类型的细胞，包括肾小管上皮细胞和免疫细胞，从而诱导氧化应激、炎症和细胞死亡[4]。木犀草素是一种次级代谢产物，广泛存在于许多植物中，金银花、菊花、荆芥、红枣等中药材中含有丰富的木犀草素[5]，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[6-8]，且具有肾脏保护作用[9-12]。微小核糖核酸（miRNA）是一种长度约为 22~26 个核苷酸的非编码 RNA，通过与一个或多个下游基因的3’非编码区结合，调控靶基因的表达，参与多种病理生理过程和疾病[13-15]。有研究[16]报道过表达 miR-30c-5p 可以显著增加人肾小管上皮细胞（HK-2 细胞）的凋亡，从而抑制肾结石的形成；Ge等[17]的研究观察到，与脓毒症非急性肾损伤患者相比，脓毒症引起的急性肾损伤患者的 miR-30c-5p 显著降低。本研究旨在探究木犀草素对LPS诱导的内毒素性所致急性肾损伤的保护作用及初步机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

CX23型显微镜和AU400型自动化学分析仪购自日本Olympus公司；T100型qRT-PCR仪和Trans-Blot SD半干式电泳转移池购自美国Bio-Rad公司。

木犀草素（批号：HY-N0162）、LPS（批号：HY-D1056）、TUNEL凋亡检测试剂盒（批号：HY-K1078）购自MedChem Express；戊巴比妥钠（批号：P3761）、蛋白酶抑制剂混合物（批号：P8465）购自Sigma-Aldrich；胱抑素C（Cys-C）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：E-EL-M3024）；肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒（批号：MTA00B）、白细胞介素（IL）-6（批号：M6000B）、IL-4（批号：M4000B）购自R&D Systems；TRIzol 试剂（批号：15596018）、BCA 蛋白质测定试剂（批号：23225）购自Thermo Fisher；Mir-X miRTM First-Strand Synthesis 试剂盒（美国TaKaRa公司，批号：638314）；SYBR Green（美国Bio-Rad公司，批号：1708891）；RIPA缓冲液（批号：CW2334）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2，批号：ab32124）、Bcl-2相关X蛋白（Bax，批号：ab182733）、GAPDH（批号：ab8245）购自Cambridge。

1.2 动物

健康C57BL/6小鼠，雄性，体重20~22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，动物质量合格证号：110011201108401228，所有程序均经国药东风总医院伦理委员会批准（院科伦审：AEWC-1908274）。将小鼠置于控制温度和湿度的无病原体条件下，小鼠自由进食和饮水，适应1周。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、建模及给药

将24只小鼠分为4组，每组6只[18]：正常对照组：连续3 d口服生理盐水（10 mL·kg^-1），第3天单次腹腔注射生理盐水，注射量为 10 mL·kg^-1；模型组（LPS组）：连续3 d口服生理盐水（10 mL·kg^-1），第3天单次腹腔注射LPS（25 mg·kg^-1）；木犀草素治疗组（LPS+Lu组）：连续3 d口服木犀草素（40 mg·kg^-1·d^-1），第3天单次腹腔注射 LPS（25 mg·kg^-1）；木犀草素治疗的阴性对照组（LPS+DMSO组）：连续3 d口服与木犀草素等量的DMSO，第3天单次腹腔注射LPS（25 mg·kg^-1）。

再取12只小鼠用miRNA antagomir对miRNA进行干预，分为2组，每组6只[19]，miR-30c-5p表达敲低对照组（antagomir NC组）：口服木犀草素前48 h，尾静脉注射50 nmol·L^-1 antagomir NC，随后连续3 d口服木犀草素（40 mg·kg^-1·d^-1），第3天单次腹腔注射 LPS（25 mg·kg^-1）；miR-30c-5p表达敲低组（antagomir 30c-5p组）：口服木犀草素前48 h，尾静脉注射50 nmol·L^-1 miR-30c-5p antagomir，随后连续3 d口服木犀草素（40 mg·kg^-1·d^-1），第3天单次腹腔注射 LPS（25 mg·kg^-1）。

LPS注射后24 h，用过量的戊巴比妥钠（800 mg·kg^-1）处死小鼠，收集肾组织和血液用于进一步分析。

1.3.2 组织病理学和生化分析

取小鼠肾组织，用4%甲醛固定6 h，石蜡包埋后，将肺部组织切成5 μm厚的切片。然后用苏木精/伊红染色，在光学显微镜下检查切片。

收集血样，离心分离小鼠血清样本，采用自动化学分析仪分析血清肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）水平。血清Cys-C水平采用小鼠Cys-C ELISA试剂盒，根据生产商说明进行分析。

1.3.3 ELISA检测炎性因子

使用无抗凝剂管收集全血样品， 4℃条件下 1 000×g离心 10 min获取血清，收集细胞培养上清液并在 4℃条件下 1 000×g离心 5 min，样本皆储存于-80℃备用。TNF-α、IL-6、IL-4水平采用ELISA试剂盒进行测定。

1.3.4 TUNEL染色检测细胞凋亡

将石蜡切片，常规脱蜡后，根据TUNEL凋亡检测试剂盒说明进行操作，DAB显色，每张玻片在5~10个区域内计算每个高倍区的TUNEL阳性细胞数量。

1.3.5 qRT-PCR检测miR-30c-5P的表达

使用 TRIzol 试剂从肾组织中提取总 RNA，并用Mir-X miR^TM First-Strand Synthesis试剂盒逆转录成 cDNA。根据制造商的说明，使用 SYBR Green在qRT-PCR仪上检测miRNAs的表达[20]。数据通过U6 归一化并采用2^-ΔΔCt分析方法进行计算。引物序列如下：miR-30c-5p：正向5'-GCGCGTGTAAACATCCTACACT-3'，反向5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'；U6：正向 5'-GCTCGCTTCGGCAGCACAT-3'，反向 5'-ATGGAACGCTTCACGAAT-3'。

1.3.6 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达

收集小鼠肾组织，肾组织在含有1%蛋白酶抑制剂混合物、1% EDTA溶液的RIPA缓冲液中裂解[21]。孵育后离心（16 100×g，10 min），收集上清液。通过 SDS 凝胶电泳分离样品并在半干式电泳转移池中电转移到聚偏二氟乙烯膜上。用 5% 脱脂奶粉溶解在含有 0.1%吐温-20（TBST） 的 Tris 缓冲盐水中，在室温下封闭膜 1 h。然后将膜与一抗在 4℃ 的摇动培养箱中孵育过夜，用 TBST 洗涤 3 次（每次 10 min），并在室温下与在封闭溶液中稀释的过氧化物酶缀合的二抗孵育 1 h。洗涤后，显影、定影后观察结果。一抗稀释度如下：Bcl-2（1 ∶ 1 000）、Bax（1 ∶ 1 000）、GAPDH（1 ∶ 1 000），蛋白印记图像用ImageJ2x V2.1.4.7软件分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，所有数据经Kolmogorov-Smirnov检验呈正态分布，均以x±s表示，两组间比较采取独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事后检验采用多重比较的 Tukey 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草素对内毒素性所致急性肾损伤小鼠具保护作用

与正常对照组相比，LPS组小鼠SCr、BUN和Cys-C的表达水平显著提高；而木犀草素治疗组则较LSP组SCr、BUN和Cys-C的表达水平显著下降（P＜0.05）。HE染色结果显示：与正常对照组相比，LPS组小鼠肾小管上皮细胞脱落，刷状缘和肾上皮细胞减少，而木犀草素则显著改善肾组织病理损伤现象。见图1和图2。

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  图1 小鼠血清SCr（A）、BUN（B）和Cys-C（C）水平（n=6）

  Figure 1.Serum SCr (A), BUN (B) and Cys-C (C) levels in mice (n=6)

  注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与LPS及LPS+DMSO组相比，bP＜0.05

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  图2 小鼠肾组织形态图（HE，200×）

  Figure 2.Histomorphology of the kidney in mice (HE, 200×)

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2.2 木犀草素抑制内毒素性所致急性肾损伤小鼠炎症

内毒素可通过增加免疫细胞中大量炎症介质的分泌来触发炎症激活[3]。与正常对照组相比，LPS组小鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α水平显著升高，抗炎症因子IL-4水平显著下降，而木犀草素能显著降低急性肾损伤小鼠模型中促炎因子的水平，提高抗炎症因子的水平（P＜0.05）。见图3。

• 
  图3 小鼠血清炎症因子IL-6（A）、TNF-α（B）和IL-4（C）水平（n=6）

  Figure 3.Serum inflammatory factors IL-6 (A), TNF-α (B) and IL-4 (C) levels in mice (n=6)

  注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与LPS及LPS+DMSO组相比，bP＜0.05

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2.3 木犀草素减弱内毒素性所致急性肾损伤小鼠细胞凋亡

细胞凋亡也是导致内毒素诱导的肾脏损伤病理生理学的一部分[4]。TUNEL染色结果显示，与正常对照组相比，注射LPS的小鼠肾脏凋亡细胞数量显著上升，而木犀草素使得凋亡细胞数量降低。此外，在LPS处理后，肾组织促凋亡因子Bax蛋白表达水平显著上升，抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达水平显著下降，木犀草素的治疗则逆转了以上现象（P＜0.05）。见图4和图5。

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  图4 小鼠肾组织的细胞凋亡图（TUNEL，200×）

  Figure 4.Apoptosis of the kidney in mice (TUNEL, 200×)

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  图5 凋亡相关因子Bax和Bcl-2表达水平（n=6）

  Figure 5.Expression level of apoptosis related factors Bax and Bcl-2 (n=6)

  注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与LPS及LPS+DMSO组相比，bP＜0.05

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2.4 木犀草素通过上调miR-30c-5p表达抑制炎症和细胞凋亡保护急性肾损伤小鼠

与正常对照组相比，miR-30c-5p表达水平在LPS组小鼠肾组织中显著下降，而木犀草素的治疗显著提升miR-30c-5p表达水平（P ＜  0.05）。为进一步研究miR-30c-5p在内毒素性所致急性肾损伤中的作用，通过小鼠尾静脉注射miR-30c-5p antagomir，并以注射antagomir NC作为阴性对照。结果表明：与antagomir NC组相比，antagomir 30c-5p 组小鼠肾组织中miR-30c-5p的表达水平显著下降（P＜ 0.05），转染成功。antagomir 30c-5p组小鼠血清IL-6、TNF-α水平显著升高，IL-4水平显著降低（P ＜  0.05），细胞凋亡显著提升（P ＜ 0.05）。见图6~8。

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  图6 血清miR-30c-5p表达水平（n=6）

  Figure 6.Expression level of serum miR-30c-5p (n=6)

  注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与LPS及LPS+DMSO组相比，bP＜0.05；与LPS+Lu及antagomir NC组相比，cP＜0.05

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  图7 进行miRNA干预后小鼠血清炎症因子IL-6（A）、TNF-α（B）和IL-4（C）水平（n=6）

  Figure 7.Serum inflammatory factors IL-6 (A), TNF-α (B) and IL-4 (C) levels in mice after miR-NA intervention (n=6)

  注：与antagomir NC组相比，aP＜0.05

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  图8 进行miRNA干预后凋亡相关因子Bax和Bcl-2表达水平（n=6）

  Figure 8.Expression level of apoptosis related factors Bax and Bcl-2 after miRNA intervention (n=6)

  注：与antagomir NC组相比，aP＜0.05

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3 讨论

本研究立足于木犀草素对肾损伤的保护作用，初步探究木犀草素介导miRNA对急性肾损伤小鼠炎性反应及细胞凋亡的机制。内毒素性导致的急性肾损伤与病情危重患者的不良结局密切相关[1]。本研究结果表明木犀草素抑制了肾功能下降，表现为SCr和 BUN 水平降低，并且减轻肾小管扩张和刷状缘缺失等结构损伤。LPS 是一种众所周知的病原体相关分子模式，由革兰阴性菌产生。在细菌性脓毒症期间，这种炎症介质与表达在许多不同类型细胞（包括肾小管上皮细胞和免疫细胞）表面的 Toll 样受体相互作用，导致细胞因子的异常分泌[3]。全身炎症介导脓毒症期间的器官功能障碍，过度炎症将导致肾损伤和肾功能恶化[22]。本研究分析了血清炎症因子水平的变化，以评估木犀草素是否发挥抗炎作用。结果表明注射LPS后血清TNF-α、IL-6水平显著上升，IL-4水平显著下降，然而木犀草素抑制了TNF-α、IL-6水平的上升，促进了IL-4水平的升高，表明木犀草素抑制了LPS诱导的炎症反应。miRNA在脓毒症患者中失调，为脓毒症预后提供关键功能[23]，曾有研究[17]报道miR-30c-5p在败血症诱导的急性肾损伤患者及脓毒症引起的急性肾损伤中显著下调。本研究发现 miR-30c-5p 在 LPS 诱导内毒素性导致的急性肾损伤模型中显著降低，这与他人的研究结果一致，而木犀草素提升了miR-30c-5p的表达水平由此实现对小鼠急性肾损伤的治疗作用。在受木犀草素治疗的小鼠体内敲低转染 miR-30c-5p的表达具有促进体内血清促炎因子IL-6、TNF-α水平及细胞凋亡的潜在能力，这表明 miR-30c-5p 可能是木犀草素治疗急性肾损伤的新靶点。

细胞凋亡也有助于脓毒症相关肾损伤的病理生理学[4]。肾小管上皮细胞暴露于 LPS 会导致严重的细胞凋亡[24]，给予泛半胱天冬酶抑制剂可减轻内毒素诱导的肾损伤中的细胞凋亡和损伤程度[25]。本研究中，LPS处理的小鼠表现出显著增加的TUNEL染色阳性细胞数量，Bax蛋白水平以及降低的Bcl-2水平，而木犀草素明显减轻了LPS对肾脏带来的不利影响。miRNA作用机制复杂，本研究仅停留在初步探索木犀草素影响miR-30c-5p由此对急性肾损伤有治疗作用，在未来的研究中，将深入木犀草素介导miRNA治疗急性肾损伤的机制。

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