目的  建立液相色谱-质谱联用法同时测定龙胆泻肝丸中高毒成分马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素的研究方法，为龙胆泻肝丸的质量控制提供技术依据。

方法  采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)分离，以0.1%甲酸溶液(含5 mmol·L^-1乙酸铵)-0.1%甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱，柱温35℃，流速0.3 mL·min^-1，进样量为5 μL。在电喷雾离子源正离子模式下，采用多反应监测方式测定，外标法定量。

结果  马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素线性关系良好，线性范围分别为9.5~94.9 ng·mL^-1、10.0~99.7 ng·mL^-1，r均大于0.9950。马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素平均回收率大蜜丸分别为81.89%（RSD=8.55%）、84.34%（RSD=8.67%）；小蜜丸分别为82.19% （RSD=7.63%）、96.05% （RSD=6.18%）；浓缩丸分别为67.99% （RSD=6.70%）、94.98%（RSD=5.01%）；水丸分别为75.98%（RSD=11.37%）、93.88%（RSD=6.01%）（n=18）。

结论  该方法操作简单，结果可行，可快速测定龙胆泻肝丸中高毒成分马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素含量。

龙胆泻肝丸是传统中成药著名的大品种之一。系由龙胆、柴胡、黄芩、栀子（炒）、泽泻、木通、盐车前子、酒当归、地黄、甘草十味药组成的中药复方制剂[1]，其中马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素均为龙胆泻肝丸中可能因误用原料药材带入的高风险成分。早在1964年，我国医生吴松寒在《江苏中医》报道了马兜铃酸的相关病例，患者服用含马兜铃酸的木通后引起了急性肾功能衰竭[2]；之后国际陆续发现马兜铃酸主要在泌尿系统、前胃和结肠出现损害甚至形成恶性肿瘤，2012年国际癌症研究所将其列为一级致癌物[3]，2017年Steven Rozen等发现亚洲地区肝癌与马兜铃酸有关，再次引起学术界极大关注[4]。2003 年，原国家食品药品监督管理局下发《关于取消关木通药用标准的通知》(国药监注[2003]121 号) ，要求将龙胆泻肝丸处方中的关木通替换为木通，因此现处方中已全部改用木通投料。当前龙胆泻肝丸中仍存在混用关木通的风险，但中国药典标准对其尚未予以控制，因此中检院申请龙胆泻肝丸中马兜铃酸Ⅰ检查项补充检验方法，该方法为液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS/MS），与传统薄层色谱法和液相色谱法比较可知，HPLC-MS/MS具有定性准确、灵敏度高、专属性强的特点，广泛应用于基质复杂的中药制剂的痕量分析及质量控制等方面。

鬼臼毒素具非常强的细胞毒性[5]，为龙胆草混用品桃儿七致中毒的主要成分。龙胆与桃儿七为不同科、属的植物, 临床上用药差别也很大，但是由于外形相似，容易混淆，该品味苦、性寒、有毒[6]，不宜内服。人体服用后轻者出现上腹部不适、轻度腹泻、头痛头晕, 重者可导致中毒身亡。鬼臼毒素目前没有相应补充检测方法，文献报道检测方法有性状特征和显微特征、薄层色谱、光谱法[7-8]、液相色谱法[9]、液质联用法[10]等。

本研究建立HPLC-MS/MS法同时检测龙胆泻肝丸中高毒成分马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素，并对当前全国生产、流通、医疗机构中的龙胆泻肝丸进行风险监测，对龙胆泻肝丸的安全用药有重要意义。

1 仪器与试药

液相串联三重四级杆质谱仪（日本岛津LC-20ADXR和美国ABI TripleQuad5500）；Secura 225D-1CN十万分之一分析电子天平（德国SARTORIUS 公司） ；QUINTIX224-1CN万分之一分析电子天平（德国SARTORIUS公司） ；MS 3 digital涡旋振荡器（德国 IKA 公司）；EOFO混合器（美国 Talboys 公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

马兜铃酸Ⅰ对照品（批号：110746-201912，含量以99.1%计）、鬼臼毒素对照品（批号：111645-201803，含量以99.6%计）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲酸、甲醇、乙酸铵均为色谱纯；水为Milli-Q纯水。

2 方法与结果

2.1 分析条件

色谱条件：以Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）为色谱柱；以0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L^-1乙酸铵）为流动相A，以0.1%甲酸乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为0.3 mL·min^-1。

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  表格1 梯度洗脱程序表

  Table 1.Gradient elution program table

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质谱条件：采用电喷雾离子源，气帘气 40 psi，雾化气 50 psi，离子化电压 5 500 eV，离子化温度 550℃，扫描模式为多反应监测模式正离子扫描，马兜铃酸Ⅰ定量离子对为质荷比（m/z）359.0→297.7，去簇电压（declustering potential，DP） 60 V，碰撞电压（collision energy，CE）20 eV，碰撞室射出电压（cell exit potential，CXP）10 V，入口电压（entrance potential，EP）10 V，定性离子对为质荷比（m/z）359.0→296.2，DP 60 V，CE 25 eV，CXP 10 V，EP 10 V；鬼臼毒素定量离子对为质荷比（m/z）415.1→247.2，DP 63 V，CE 25 eV，CXP 15 V，EP 10 V，定性离子对为（m/z）415.1→229.2，DP 63 V，CE 35 eV，CXP 15 V，EP 10 V。

2.2 对照品溶液制备

马兜铃酸Ⅰ储备液：精密称取马兜铃酸Ⅰ 9.58 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度即为0.949 mg·mL^-1。

鬼臼毒素储备液: 精密称取鬼臼毒素10.01 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度即为0.997 mg·mL^-1。

混合对照品溶液：分别精密吸取马兜铃酸Ⅰ储备液和鬼臼毒素储备液0.1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密吸取上述溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，浓度分别为 0.949，0.997 μg·mL^-1。

2.3 供试品溶液制备

取装量差异项下的水丸，研细，取约1 g或取重量差异项下的浓缩丸，研细，取约1 g，精密称定，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，精密加入甲醇10 mL，涡旋使药粉充分浸润，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。或取重量差异项下的蜜丸，剪碎，取约1 g，精密称定，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，准确加入甲醇10 mL，置涡旋振荡器上剧烈振荡10 min，待样品充分分散后，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性试验

取不含马兜铃酸I及鬼臼毒素为阴性样品、混合对照品溶液和加标供试品溶液, 在上述分析条件下进样分析, 比较阴性样品、混合对照品溶液和加标供试品溶液的总离子图。阴性样品对待测成分无干扰，表明该方法专属性较好。图1为大蜜丸（批号：113011）总离子图谱。

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  图1 专属性试验总离子图

  Figure 1.Total ion diagram of specificity test

  注：1. 鬼臼毒素；2. 马兜铃酸Ⅰ

  

2.4.2 线性关系考察

精密移取10，20，30，50，100 μL混合对照品溶液, 用各基质溶液定容至1 mL,制成一系列浓度混合对照品溶液, 在上述分析条件下进样分析, 记录色谱图。以对照品浓度为横坐标（X，ng·mL^-1）,峰面积为纵坐标（Y）, 分别计算大蜜丸、小蜜丸、浓缩丸、水丸不同基质的马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素的线性回归方程和相关系数。结果表明，马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素分别在9.5~94.9 ng·mL^-1、10.0~99.7 ng·mL^-1内呈良好线性关系，r均＞0.9950，结果见表2。

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  表格2 4种基质的线性关系

  Table 2.Linear relationships of four matrices

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2.4.3 回收试验及重复性试验

取不含马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素成分的样品（大蜜丸，批号：113011；小蜜丸，批号：201101；浓缩丸，批号：200923；水丸，批号：181028）作为空白基质，分别精密吸取混合对照品溶液0.1，0.2，0.5 mL配制成低、中、高3种浓度水平加标溶液，每个浓度平行添加6份，采用“2.3”项下方法进行处理，按“2.1”项下分析条件进样测定并分别记录大蜜丸、小蜜丸、浓缩丸、水丸不同基质的马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素的峰面积，计算回收率及RSD值，结果显示，大蜜丸中的马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素平均回收率分别为81.89%（RSD=8.55%），84.34%（RSD=8.67%）（n=18）；小蜜丸分别为82.19%（RSD=7.63%），96.05%（RSD=6.18%）（n=18）；浓缩丸分别为67.99%（RSD=6.70%），94.98%（RSD=5.01%）（n=18）；水丸分别为75.98%（RSD=11.37%），93.88%（RSD=6.01%）（n=18）。其中各空白基质的高浓度水平加标溶液6份进样测定，计算马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素含量的RSD值。结果显示，马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素RSD分别为大蜜丸5.73%，6.26%；小蜜丸4.70%，4.68%；浓缩丸5.89%，3.76%；水丸5.81%，5.00%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.4.4 精密度试验

取“2.4.2”项下浓度为50 ng·mL^-1混合对照品溶液, 在上述分析条件下连续进样6次, 分别记录大蜜丸、小蜜丸、浓缩丸、水丸不同基质的马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素的峰面积, 计算RSD值。RSD分别为大蜜丸3.70%，2.72%；小蜜丸2.94%，3.86%；浓缩丸2.77%，2.73%；水丸2.41%，1.73%（n=6）。表明仪器的精密度良好。

2.4.5 稳定性试验

取各空白基质的高浓度水平加标溶液1份，分别于0，2，4，10，14，18，24 h按“2.1”项下分析条件进样，测定马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素的峰面积以考察样品稳定性。结果24 h内RSD分别为大蜜丸12.78%，6.04%；小蜜丸11.99%，6.98%；浓缩丸8.64%，3.85%；水丸8.08%，10.55%（n=7）。表明对照品溶液在24 h内较为稳定。

其中各空白基质的高浓度水平加标溶液6份进样测定，计算马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素含量的RSD。结果马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素RSD分别为：大蜜丸5.73%，6.26%；小蜜丸4.70%，4.68%；浓缩丸5.89%，3.76%；水丸5.81%，5.00%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.4.6 样品测定

118批样品采用 “2.3”项下方法按“2.1”项下分析条件进行测定，结果均未检出马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

比较了Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Agilent Eclipse Plus RRHD C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Thermo Hypersil GOLD C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Water ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）四种型号的色谱柱均能检测两种成分，且能满足色谱峰与基线分离,其中Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱的对称因子及响应均最佳，故选用此色谱柱。

3.2 流动相的选择

考察了0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸（含5 mmol·L^-1乙酸铵）-乙腈、0.1%甲酸（含5 mmol·L^-1乙酸铵）-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸-甲醇乙腈（6 ∶ 4）不同流动相对分离效果影响，发现在流动相中添加适量甲酸和乙酸铵有利于目标成分的离子化，改善峰形，故选用0.1%甲酸（含5 mmol·L^-1乙酸铵）-0.1%甲酸乙腈作为该方法的流动相。

3.3 提取方法的选择

考察了提取溶剂甲醇、0.5%氨水甲醇、0.1%甲酸甲醇、70%甲醇、0.5%氨水乙腈、0.1%甲酸乙腈提取效果，发现70%甲醇以及以乙腈作为提取溶剂均不能分散大蜜丸，估计含有水分不能与大蜜丸中的油脂类成分混合使溶散，同理乙腈渗透能力比甲醇弱，所以不能充分提取目标成分。甲醇的酸碱性对目标成分提取影响并不明显，故选用纯甲醇作为提取溶剂。另考察了QuEChERS（Quick，Easy，Cheep，Effective，Rugged，Safe）法简单提取技术对基质进行净化，以便提高目标成分响应值，分别以佛罗里硅土、氧化铝、氨基、N-丙基乙二胺（PSA）、硅胶、活性炭、硅藻土7种净化材料考察对目标成分是否吸附，发现氧化铝、氨基、PSA、活性炭对马兜铃酸Ⅰ有明显吸附作用，另外不同基质用同一种净化材料也有不同程度的吸附作用，影响目标成分回收率，因此甲醇提取后，直接进样，操作简单方便。

为评价基质效应，分别使用甲醇制成空白溶剂以及大蜜丸、小蜜丸、浓缩丸、水丸4种空白样品基质溶液配成质量浓度为10~100 ng·mL^-1的标准工作溶液，以外标法制作标准曲线，样品基质溶液标准曲线的斜率与空白溶剂标准曲线的斜率比即为该样品的基质效应的影响值（SSE）[11]，当SSE在80%~120%之间时，可认为基质效应对目标成分的检测结果影响不大。结果显示，各基质的SSE值为马兜铃酸Ⅰ 61%~79%、鬼臼毒素70%~160%，可见四种基质各存在基质效应，因此应采取基质标准曲线进行定量检测。

3.4 小结

本试验以龙胆泻肝丸为研究对象，首次建立同时测定高毒性成分马兜铃酸Ⅰ与鬼臼毒素的方法，同时对提取条件、色谱条件以及定量检测等参数进行优化。方法学验证表明, 所建立的含量测定方法满足定量要求, 操作简单, 可为龙胆泻肝丸中的马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素进行质量评价，为其他中药制剂中含马兜铃酸Ⅰ及鬼臼毒素等高毒性成分的质量研究提供了参考依据。

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