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单克隆抗体类药物是近年来生物制药领域增长率最快的一类生物技术药物，以其靶向性强、治疗效果明显等优势在癌症、自身免疫性疾病等领域应用广泛。宿主细胞残留蛋白（HCP）是其生产中无法去除且易引起免疫原性的一类工艺杂质，HCP含量测定是单抗药物质量控制中重要的一项指标。酶联免疫法（ELISA）是目前HCP检测最常用的方法，可以定量检测HCP的总量，但存在局限性。而质谱法作为一种高精密度高准确性的检测方法，已被应用于单克隆抗体类生物药物生产工艺中HCP的监测，可以与ELISA形成互补，弥补ELISA方法存在的不足，为生产条件优化、纯化效果验证提供了依据。文中将从样品前处理技术、分离技术以及数据采集技术3个方面介绍近年来质谱技术在单克隆抗体类药物HCP研究中的应用与进展，为后续质谱法应用于HCP检测研究提供了参考和指导。
单克隆抗体（mAb）类药物是用于治疗癌症、自身免疫性等疾病的靶向生物治疗药物,因其良好的治疗效果，逐步在医疗市场占据重要地位，并改变了部分疾病的治疗方式[1-2]。此类药物主要通过基因重组技术生产，其生产依赖于中国仓鼠卵巢或其他宿主细胞系等生物系统。虽然在生产过程中，使用多种手段进行分离和纯化，但是宿主细胞自身分泌表达的宿主细胞残留蛋白（host cell proteins，HCP）仍不能被完全去除，而有少量会残留在终产品中[3-4]。HCP的存在可能会导致不同的人体反应，部分HCP由于其异源性具有免疫原性，即使浓度不高，也可能造成一定的免疫反应[5]，部分HCP可能是人体中本身含有的蛋白，而这些蛋白的增加可能会引起人体正常的机体反应发生变化，从而影响药物的安全性[6-7]。在复杂的HCP群中还存在蛋白酶类物质，此类蛋白会参与到mAb蛋白的折叠或者水解过程，破坏了药物的稳定性[8-10]。因此，HCP一直作为mAb类药物的一个关键质量属性而被严格控制。
美国食品药品管理局（FDA）要求单抗类产品中HCP含量应该控制在100 ng·mg-1以下[11]。目前已有多种方法可用于HCP 的检测，其中主要包括：酶联免疫法（ELISA）、二维荧光差异凝胶电泳法（2D-DIGE）、蛋白质印记法（Western blot）、邻位连接分析法（PLA）以及质谱法等。其中ELISA法是目前应用最广泛的HCP残留检测方法，已批准上市的单抗类制品的质量标准中均采用ELISA的方法用于HCP含量的检测[12]。通过将宿主细胞裂解蛋白或者培养基中上清液注射到动物体内产生免疫，获得用于HCP测定的多克隆抗体，但并不是所有HCP都能与生产的多克隆抗体产生免疫反应，因此ELISA法不能覆盖所有 HCP[1-2]。另外，ELISA法仅能提供HCP中蛋白的总量，不能提供 HCP 中具体蛋白质的种类信息[13-14]。2D-DIGE、Western blot、PLA等方法主要用于工艺开发中HCP的监测[15-17]，以及工艺参数的优化和调整，但由于操作复杂、灵敏度差、成本高等缺点 ，应用相对较少[18-19]。而随着质谱技术的不断发展，高分辨率质谱仪器的出现为质谱技术在HCP检测中的应用提供了可能，目前质谱技术已是单抗类制品中工艺开发常用的技术之一。与ELISA等方法相比，质谱技术可以提供HCP中单个蛋白的信息，是对ELISA方法很好的补充[20-22]。质谱法用于mAb类药物中HCP检测是采用蛋白质组学分析的理念，将蛋白裂解为肽段后，在肽段水平进行检测，分析流程大致分为：样品前处理、样品分离、数据采集与分析（图1）。由于HCP的含量较低，为了实现HCP的检测，每步分析流程中又有其特殊性，因此本文对质谱法在mAb类药物中HCP检测的进展做了总结和阐述。其中质谱数据分析是基于搜索软件的数据库检索，虽然不同的软件算法可能不同，但最终结果差异并不大，在此对于数据分析不做过多的介绍，主要从样品前处理技术、分离技术、质谱数据采集技术3个方面进行介绍。
1 样品前处理
由于经过多步的工艺纯化，mAb类制品中HCP浓度与主成分之间相差约5~6个数量级，在使用质谱分析时，高浓度的主成分必然会掩盖HCP的信号，导致HCP的鉴定结果差。选择合适的样品前处理方法，减少质谱检测时主成分信号的干扰，对于HCP的检测尤为重要。
目前常用的样品前处理方法主要有3种。
1.1 富集HCP
mAb蛋白的相对分子质量普遍在150 kDa以上，与HCP的相对分子质量相差较大，可以通过相对分子质量截留过滤（MWCO）的方式对其进行富集。Chen等[23]利用50 kDa超滤管对样品进行预处理，使相对分子质量较大的mAb蛋白被截留在超滤管内，而较小的HCP蛋白可自由通过超滤膜，从而实现对主成分的去除，及HCP蛋白的富集。经实验验证，该方法可以检测低至8 ng·mg-1的HCP，在对NIST mAb（一种用于mAb样品质量评估的重组人源IgG样品标准品）的分析中检测出150多种HCP。且两次平行实验中，共同鉴定出的蛋白数占总检出蛋白数97%，表明该方法重现性良好，是一种稳定的质谱前处理方法。但使用MWCO技术，会导致相对分子质量较大的HCP流失而不能被检测，可将该方法与其他方法结合使用，增加HCP检测的覆盖率。Mörtstedt等[24]开发了一种命名为“ProteoMiner”的低丰度蛋白富集试剂盒，其原理是在微球上连接多种配体，每种蛋白配体数量保持一致，过量的高浓度蛋白会因无法与配体结合而被除去[25]。其利用该技术可以特异性筛选mAb样品中低丰度的HCP，而没有与结合位点结合的那些过量的mAb就会被洗脱去除，从而减少样品中mAb蛋白的含量。此方法显著降低了HCP与mAb药物主成分间的浓度差异，使DDA方法的检测限从1 000 ng·mg-1提升到30 ng·mg-1，部分肽段在质谱中的信号增强百倍之多，可鉴定出30种HCP，是未经富集处理样品的一倍。在未使用同位素标记法用于定量情况下，实验得出标准蛋白的测量浓度与实际蛋白浓度差异程度处于可接受范围内。亲水作用色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的极性物质的保留能力的色谱技术。Wang等[26]利用HILIC进行mAb样品初步分离，将样品分离为主峰前、主峰和主峰后3组。主峰前样品因为没有了mAb蛋白干扰更加易于检出 ，此方法在NIST mAb中鉴定出20种以往方法未能鉴定到的HCP，对于添加1 000 ng·mg-1浓度 HCPs的BMS mAb（一种人源IgG mAb样品），检测到83种HCPs。此方法使用难度较低，可以在大多数质谱实验室完成，是样品前处理的一种新选择。
1.2 改变酶解条件
mAb蛋白与HCP相比，空间结构较为复杂，在保持其空间结构的条件下，更难被酶解。可利用两者差异，改变酶解条件，降低高浓度主成分肽段信号对HCP肽段信号的干扰。Huang等[27]对样品不预先进行变性处理，直接用胰蛋白酶处理样品后进行还原，然后用热变性方法沉淀mAb蛋白，降低酶解出的HCP肽段浓度与mAb蛋白肽段浓度差距。此方法在mAb浓度为12.5 mg·mL-1制剂中，检测限低至0.5 ng·mg-1，在NIST mAb中检测出46种传统变性酶解方法未检测到的HCP。该方法加入的标准蛋白回收率在98%~169%之间，虽然不能精准定量每种蛋白，但定量结果足以支持纯化工艺的开发。在以往的方法中，为了使蛋白质酶解完全，一般会添加过量的酶进行酶解，但是这种方法会导致mAb蛋白过量酶解，增加了mAb信号对HCP信号的干扰。Nie等[28]在样品不预先进行变性处理条件下，以1 ∶ 10 000（酶 ∶ 蛋白，W/W）的比例添加胰蛋白酶进行酶解。此方法可以有效避免过量mAb蛋白被酶解，使背景干扰减小。此方法可稳定检出浓度为0.5 ng·mg-1以上HCP，在NIST mAb中检出453种蛋白,远高于其他方法，为样品前处理提供了新思路。
1.3 改变变性剂选择
脱氧胆酸钠（SDC）是常用于溶解膜蛋白的阴离子型表面活性剂，与其他盐类相比与酶类有更好的相容性。Li等[29]使用SDC对样品进行变性处理，在样品还原烷基化、酶解后加入甲酸酸化，酸化后SDC不稳定发生沉淀，离心处理后即可被去除，无需额外除盐步骤，取上清液即可进行质谱分析。以7-STD（7种商用蛋白质，常用于模拟HCP）和48 UPS-1（通用蛋白质组学标准蛋白样品）分别模拟mAb样品中残留的HCP进行检测，此方法能够在不同条件下检测出10 ng·mg-1以上浓度所有蛋白，且平行实验中7-STD检出肽段数量的RSD值为9.8%，变异度较小。这种新方法与以往方法性能相似，因为减少了除盐步骤，节省了处理时间，且减少了除盐过程中蛋白损失。这种SDC变性方法是一种快速、稳定的HCP前处理方法，在HCP检测中有着良好前景。
2 分离技术
mAb样品中蛋白种类较多，在质谱分析前对其进行有效的分离，使不同蛋白在不同时间被电离产生信号，可以提高检测灵敏度。目前常用分离方式主要包括液相色谱法（LC）和毛细管电泳法（CE）。其中LC是使用时间最久，也是最常见的分离技术。
Walker等[30]利用Waters Acquity H-class Bio UHPLC一维液相系统对添加了48 UPS-1模拟样品进行了分离，在2个月以内的5次LC-MS分析中，5种不同的肽段保留时间的平均相对标准偏差为1.1%，表明LC分离具有良好的重现性。此方法可以对低至10 ng·mg-1的蛋白进行定量分析。但一维色谱分离通常具有大约3个数量级的分离能力,难以分离复杂的蛋白质样品。二维色谱的分离能力就显著高于一维色谱，一段时间内，这种以时间换取检测能力的分离方式是HCP检测的主流分离方式。Doneanu等[31]先使用C18反相色谱柱进行第一维高pH（pH=10）分离，再使用C18 BEH300反相色谱柱进行第二维低pH（pH=2.4）分离,两维分离系统pH值、流动相等色谱参数完全不同，在分离能力上形成了正交，从磷酸化酪氨酸抗体（PTG1 mAb）样品中共鉴定出33种HCP。然而此方法的低通量严重限制了该方法在实际中应用，目前已较少采用该方法进行分离。Yang等[32]使用一维离线色谱对样品进行了初步分离，收集出的馏分使用LC-MS联用技术进行第二维的色谱分离和质谱鉴定。该方法在10 ng·mg-1浓度水平的HCP检出率可达90%。但为了提高低丰度HCP的检出量，一般会增加LC的分离时间，难以达到真正高通量分析。为克服以上不足，高通量蛋白组学分离系统Evosep One LC应运而生。此液相系统同时具备高低压双重管路系统设计、样品洗脱和梯度预存储技术，低压泵用于洗脱Evotip中的样本和进行下一梯度的预设，高压泵用于将存储环中的液体推入与质谱相连的分析柱中，无需设置样品间平衡时间，能够大幅度减少LC分析时间，使质谱发挥出自身最大性能。Ma等[33]把Evosep ONE LC分离系统与Orbitrap Lumos质谱仪相结合，色谱分离时间从以往的数小时降低到21 min，在NIST mAb中可以检测出55种HCP，检测限低至0.1 ng·mg-1，在3次平行试验中，共同检出的HCP占总数的80%以上，有两组共同检出的HCPs占总数90%以上，表明该方法重现性良好。此外，在追求高覆盖率的3 h长梯度分离时间方案中，能检出多达171种HCPs。
CE法也是一种出色的分离方法，具有高灵敏度、高分析效率、低样品损耗等优点[34]。近年来，由于CE-MS技术的发展，使毛细管区带电泳方法在HCP检测中逐渐占有一席之地[35]。与UPLC方法相比，其运行时间短、分离效率高且需要的样品量小，使其在较少量的样品分析中有较大优势。Zhang等[36]使用了CZE-MS方法鉴定CHO K1SV株原液中的HCP，并对其进行了定量分析。结果表明，此方法可以在100 ng·mg-1水平上检测到肽段，且在50 ng进样量的条件下检出的肽段数与使用UPLC分离方法进样量为1 μg条件下相似。在mAb样品分析中，不去除mAb进行分析时共鉴定出191个蛋白，在去除mAb进行分析时鉴定出222个蛋白，其中有24种蛋白只存在于不去除mAb组，表明其可能与mAb蛋白存在相互作用。
3 数据采集模式
过去10年间，质谱采集技术的发展也推动着HCP检测研究发展，质谱数据采集模式可以分为两大类：数据依赖性采集（DDA）和数据非依赖性采集（DIA）。
DDA即数据依赖性采集模式，在这种模式下质谱根据离子化的肽段母离子强度，一次选择多个强度最大的离子进行二次碎裂[37]，可以同时获得一级质谱和二级质谱信息。Yang等[32]使用DDA模式对2D-LC分离的样品进行质谱检测，在48 UPS-1样品中检测出35种蛋白，检测限低至10 ng·mg-1。Ma等[33]使用top10 DDA方法对NIST mAb样品进行质谱检测，共检出55种HCP。由于DDA方法不对离子进行筛选，只能收集到强度较高的离子信号，导致结果重复性较差且灵敏度较低。随着高分辨率高灵敏度质谱仪器的出现，以及针对性较强的样品前处理方法开发应用，使以上情况得到改观，DDA方法仍旧在HCP检测领域占有一席之地。
DIA模式可以将一定范围质量数母离子全部打碎，从而采集到更为丰富的碎片离子[38-39]。常见的DIA采集模式有全信息串联（MSE）、所有理论碎片离子的连续窗口采集（SWATH）、平行反应监测（PRM）、多反应监测（MRM）等。 MSE模式下质谱会同时采集所有母离子的碎片离子，这样就有效避免了由于DDA导致的信息不全，低丰度信号难以检测到等问题。Farrell等[40]将2D-LC与质谱联用，使用MSE模式进行数据采集用于HCP的定量分析。经验证，该方法最低可检测浓度低至9 ng·mg-1的HCP，且在浓度为9~273 ng·mg-1范围内HCP提取离子（EIC）峰面积与HCP含量线性关系良好。与传统DDA方法相比，检测限更低，且检测到HCP种类更多，但是可能存在短时间内离子信息过多相互干扰等问题。SWATH不同于MSE方法使用的单个m/z采集窗口，SWATH技术将扫描分为多个窗口进行，由于窗口较小，完美解决了隔离窗口过大引起的杂峰问题。Walker等[41]利用SWATH技术开发了一种快速准确的1D UPLC-MS/MS工作流程，用于工艺生产中的HCP清除率监测。检测限最低可达5 ng·mg-1，与DDA方法相比，该方法灵敏度提高了5倍。此方法因为不需要额外的2D-LC分离过程，实现了高效快速灵敏的HCP定性定量分析。
DIA方法因本身筛选离子较多信号干扰严重，导致难以实现高通量高准确的定量分析，MRM法基于目标蛋白的特定母离子和子离子对实现定量分析，通过对母离子和子离子的双重筛选，可去除干扰离子，提高灵敏度，可以实现对目标蛋白进行较为精准的定量分析。Gao等[42]利用MRM方法建立了一套用于定量检测mAb生产中高危蛋白的实验流程。在不同样品中添加磷脂酶B2（PLBL2）和溶酶体磷脂酶（A2LPLA2）两种常见的具有免疫原性的HCP，经验证这两种HCP在32~735 ng·mg-1浓度范围内浓度与信号强度比值线性良好，定量结果较为准确。PRM是MRM的衍生技术，此技术仅预先设定母离子，对子离子信号全部进行采集，相比MRM有更好的定量准确性。Kreimer等[43]建立了一种新型的PRM流程用于工业生产中HCP精准定性定量分析。首先使用DIA流程建立蛋白数据库，然后使用PRM方法进行定性和定量分析，可完成2.5 ng·mg-1以上浓度蛋白的准确定量分析。Meier等[44]发展了一种新型数据采集模式：BoxCar，此种方法其将质谱一级扫描分为相隔窗口，每个窗口都设置最大离子容量以及最大注入时间，这样就能使高浓度信号的掩盖效应仅发生在一个窗口内。之后这些离子在C-Trap中贮存，达到设定的数目后，进入Orbitrap进行扫描，由于C-Trap储存离子总量被设置为固定值，低丰度离子可以通过延长注入时间增大丰度，从而提高质谱检测灵敏度。Nie等[28]利用BoxCar数据采集模式进行了单抗样品的分析，在NIST单抗mAb标准品中鉴定出453种HCP，检测限低至0.5 ng·mg-1，与传统方法差别巨大。BoxCar方法有效实现了对HCP检测的深度覆盖，在未来有着巨大发展潜力 。
4 小结
随着基因工程制药行业迅速发展，对mAb类药品的质量要求也日益严格。HCP含量作为mAb类药物质量控制中的一个关键质量属性，一直被严格控制。现有多种用于HCP检测的方法因为其无法克服的局限性已难以满足检验需要，质谱技术因其本身的优势逐步在HCP检测领域受到关注。本文从样品前处理、分离技术以及质谱数据采集模式等方面介绍了目前质谱技术在HCP研究中的应用（表1）和进展。虽然，质谱技术还不能够替代ELISA法用于单抗终产品的质控，但是其可以对ELISA的结果进行很好的补充，并且由于其开发的便捷性已被应用到了mAb类药物的工艺开发。
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