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目的 探讨熏洗汤熏蒸对椎间盘退变模型中聚集蛋白聚糖（AGG）与Ⅱ型胶原（COL2A1）表达的影响，深入理解中药熏洗疗法在细胞和分子水平上的作用机制。
方法 采用Sprague-Dawley大鼠构建椎间盘退变模型，通过针刺法造成椎间盘损伤。将大鼠分为正常对照（CON）组、模型（PUN）组和熏蒸（CHF）组，CHF组接受熏洗汤熏蒸治疗，持续4周。影像学检测椎间盘相对高度，使用Masson三色染色观察椎间盘结构变化；免疫组化检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体的表达；采用定量反转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹法评估AGG和COL2A1基因和蛋白表达变化。
结果 12只SD大鼠随机分为3组，每组4只。与CON组相比，PUN组椎间盘高度明显丢失（P＜0.05），CHF组可以部分恢复椎间盘高度（P＜0.05）。PUN组髓核组织中AGG mRNA和COL2A1 mRNA及蛋白表达较CON组明显下降（P＜0.05）；CHF组髓核组织中AGG mRNA和COL2A1 mRNA及蛋白表达较PUN组有明显提高（P＜0.05）。组织学检测显示，与PUN组相比，CHF组髓核凝胶特性部分恢复，聚多糖含量回升；CHF组髓核组织中NLRP3表达明显减低。
结论 熏洗汤熏蒸治疗能提高椎间盘退变模型中AGG和COL2A1的表达，降低NLRP3的表达，这可能是其治疗腰椎退变性疾病的作用机制之一，本研究为椎间盘退变性疾病的治疗提供了新思路。
腰椎退变性疾病（lumbar degenerative diseases，LDD）是以椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）为核心病理特征的脊柱退行性疾病。随着人口老龄化加剧及现代生活方式改变，其发病率逐年攀升，已成为全球范围内重大公共卫生问题[1]。LDD以椎间盘基质降解为特征性改变，其中聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）作为维持髓核水合状态的核心蛋白聚糖，其降解直接导致椎间盘生物力学功能丧失；而Ⅱ型胶原（collagen type II alpha 1，COL2A1）构成的纤维网架结构破坏，则加剧椎间盘结构失稳[2]。这种进行性退变最终压迫神经根或脊髓，引发一系列临床症状，如腰部疼痛、下肢放射痛、麻木、活动受限，甚至更严重的神经功能障碍，影响患者的生活质量。现代医学对LDD的干预策略主要包括保守治疗、微创手术、开放手术等。保守治疗以对症治疗为主，包括非甾体抗炎药、肌肉松弛剂、营养神经药物和物理治疗等，虽能短期缓解症状，但其局限性日益凸显；无论是微创手术还是开放手术，虽能解除机械压迫，却难以逆转退变进程[3]。中医学基于“肾主骨”“肝主筋”理论，将LDD归为“骨痹”“筋伤”范畴，《医宗必读》提出“治痛痹者，散寒为主，疏风燥湿仍不可缺，大抵参以补火之剂”的治则，现代临床实践证实补肾强骨、通络止痛类中药可通过多靶点干预延缓退变进程[4-5]。值得关注的是，中药外治法具有局部药物浓度高、不良反应小等优势，在骨科领域展现出独特价值[6]。华中科技大学同济医学院附属协和医院的临床经验方熏洗汤通过透皮给药实现温经通络之效，对各种关节痛、肌痛、腰痛具有明显的治疗作用，但其作用机制尚未明确。
目前研究多聚焦于中药内服对椎间盘细胞的影响，而外治法在IDD中的分子调控机制研究甚少。基于蛋白聚糖-胶原网络在椎间盘稳态中的关键作用，本研究拟通过建立IDD动物模型，采用免疫组化、蛋白质印迹（Western blotting）等技术，系统观察熏洗汤熏蒸治疗对AGG、COL2A1表达的调控作用，揭示中药外治法延缓IDD的分子机制，为优化临床治疗方案提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 仪器
LEiCA RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），NIKON ECLIPSE CI正置光学显微镜（日本尼康公司），mμ lISKANMK3酶标仪（美国Thermo公司），ChemiDoc™ XRS+凝胶成像系统（美国Bio-rad公司），DYCZ-24DN垂直电泳槽（北京六一仪器厂），DYCZ-40电转仪（北京六一仪器厂），HI650离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），A300 PCR仪（杭州LongGene公司），QuantStudio 12K实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），Chemi-DocMP成像系统（美国Bio-Rad公司），HYZ-IB熏蒸装置（河南翔宇医疗公司）。
1.2 药品与试剂
Trizol试剂（晶科德生物科技武汉有限公司，批号：603072921），SYBR Premix Ex Tag试剂盒（擎科生物科技有限公司，批号：1F124601），RIPA裂解缓冲液（碧云天生物技术股份有限公司，批号：092221220307），抗AGG（英国Abcam公司，批号：GR103983-1）、COL2A1（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：00140436）、NLRP3（美国proteintech，批号：00092561）和GAPDH一抗（美国Proteintech，批号：10028231），增强化学发光试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific，批号：2600181），Masson 染液套装（武汉赛维尔生物科技有限公司：批号：GP2105474），COL2A1和AGG引物合成（南京擎科生物科技有限公司，批号：TSP20250106-027-00193），甲醛缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GP2212019）。
熏洗汤为医院自制，处方：寻骨风15 g、当归尾12 g、凤仙透骨草15 g、海桐皮12 g、续断片12 g、伸筋草15 g、花椒12 g，加入1 000 mL纯净水，自动煎药机煎煮成70%浓度的中药液保存。所用药材均由华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科提供（批号：202406013）。
1.3 实验动物
健康清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠，2月龄，雄性，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，合格证编号：430726241100700154，动物伦理批号：AMUWEC20210946。SD大鼠饲养于SPF级环境中，用独立通风笼具，室温22~25 ℃，小鼠自由摄食和饮水。
1.4 研究方法
1.4.1 大鼠IDD模型的构建
采用针刺法建立IDD模型[7]。用2%（w/v）戊巴比妥40 mg·kg-1麻醉大鼠，然后用20号针从背侧穿过尾部皮肤刺穿大鼠椎间盘（Co5/6、6/7、7/8和8/9），在椎间盘内停留10 s，穿刺针长度预先确定，以确保穿刺深度约为4 mm。通过影像学及组织学检查评估退变改变。
1.4.2 动物分组及熏洗汤熏蒸治疗IDD
12只SD大鼠随机分为3组：正常对照（CON）组、模型（PUN）组和熏蒸（CHF）组，每组4只。CON组不造模，不采取任何干预措施，常规饲养，自由活动。其余大鼠适应性饲养1周后，按“1.4.1”项下方法造模。PUN组单纯造模，正常饲养，无特殊干预；CHF组造模成功后第2天，给予熏洗汤熏蒸治疗，将大鼠放入动物熏蒸装置，加入熏洗汤药液200 mL进行全身熏蒸，蒸汽温度为40~45 ℃，每天1次，每次23 min，连续治疗4周。
1.4.3 标本采集及处理
4周后处死各组大鼠，收集椎间盘及邻近椎体，一部分组织迅速置于液氮中冰冻，转入-80 ℃冰箱中保存待用；另一部分组织固定，脱钙，石蜡包埋，制作切片。
1.4.4 定量反转录聚合酶链式反应
用Trizol试剂从髓核组织中提取总RNA，然后根据标准实验方案通过定量反转录聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）进行逆转录和扩增。采用逆转录酶由总RNA生成互补DNA（complementary DNA，cDNA），实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）使用SYBR Premix Ex Tag试剂盒进行。扩增循环条件包括40个循环：每个循环在95 ℃变性5 s，随后在60 ℃下扩增24 s。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参。PCR引物序列包括 COL2A1, 209bp, F:5'-TCCTAAGGGTGCCAATGGTGA-3', R:5'-AGGACCAACTTTGCCTTGAGGAC-3'AGG,240bp,F:5'-CAGAATGGGAACCAGCCTATAC-3', R:5'-GCCTTCTGTACTTTCCTCTGTT-3'，引物合成。使用GAPDH进行标准化。所有数据均进行3次测试，取其平均值。
1.4.5 Western blotting
使用RIPA裂解缓冲液从大鼠髓核组织中提取总蛋白。使用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。使用400 mA恒定电流将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上2 h，然后在25 ℃下用5%脱脂牛奶封闭1 h。然后，4 ℃下与稀释的抗AGG（1 ∶ 100）、COL2A1（1 ∶ 30）和GAPDH一抗（1 ∶ 5 000）孵育过夜。随后，与1 ∶ 3 000稀释的二抗在25 ℃下孵育1 h。使用增强化学发光试剂盒评估蛋白表达水平，并使用Chemi-DocMP成像系统进行可视化。
1.4.6 椎间盘高度与组织学检测
采集各组大鼠鼠尾椎间盘，拍摄数字X线照片，计算椎间盘高度指数（disc height index，DHI），用于评估椎间盘的高度。DHI=侧位椎间隙高度/相邻椎体高度。
将大鼠鼠尾椎间盘在磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）中洗涤，用4%甲醛缓冲液（pH 7.4）固定12 h，在10%甲酸溶液中脱钙，乙醇脱水，并行石蜡包埋。标本切成4 µm切片，脱腊和再水化，并用Masson三色染色，观察椎间盘纤维环组织及髓核组织结构变化。
1.4.7 免疫组化检测
将大鼠椎间盘髓核组织石蜡包埋后制备成4 mm厚切片。切片与一抗[NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein3，NLRP3）炎症小体，1 ∶ 500]于4 ℃孵育过夜。PBS清洗切片3次后加入二抗，室温避光孵育2 h并进行DAPI染色、封片，荧光显微镜下观察。
1.5 统计学分析
采用GraphPad Prism 5软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠IDD情况
与CON组相比，PUN组大鼠椎间盘高度明显丢失（P＜0.05）；与PUN组相比，CHF组经熏洗汤熏蒸可以部分恢复椎间盘高度（P＜0.05）。见图1。
2.2 大鼠尾椎间盘组织中AGG mRNA和COL2A1 mRNA表达
PUN组髓核组织中AGG mRNA和COL2A1 mRNA的表达较CON组明显下降（P＜0.05）；CHF组髓核组织中AGG mRNA和COL2A1 mRNA的表达较PUN组有明显提高（P＜0.05）。见图2。
2.3 大鼠尾椎间盘组织中AGG和COL2A1蛋白表达情况
PUN组髓核组织中AGG和COL2A1蛋白的表达较CON组明显下降（P＜0.05）；CHF组髓核组织中AGG和COL2A1蛋白的表达较PUN组有明显提高（P＜0.05）。见图3、图4。
2.4 椎间盘组织学评估
CON组鼠尾椎间盘髓核组织呈椭圆形凝胶状结构，边界清晰，聚多糖浓集；PUN组髓核脱水皱缩，凝胶基质崩解，聚多糖含量下降，椎间盘高度塌陷；而CHF组髓核凝胶特性部分恢复，聚多糖含量回升，椎间盘高度部分恢复，提示病理学改变明显减轻。见图5。
2.5 椎间盘髓核组织NLRP3的表达变化
CON组鼠尾椎间盘髓核组织有少量NLRP3炎症小体的表达，PUN组髓核组织结构紊乱，NLRP3表达显著增高；与PUN组相比，CHF组髓核组织NLRP3的表达明显减低。见图6。
3 讨论
中医药在治疗LDD方面积累了丰富的经验，并提供了一种不同于现代医学的视角和解决方案[4, 8-9]。中医理论强调整体观念和辨证论治的原则，认为人体是一个有机的整体，疾病的产生是由于内外环境失衡所致。基于此理念，熏洗汤通过外治法直接作用于病变部位，体现了中医药治疗的特性和优势。熏洗汤组方包括寻骨风、当归尾、凤仙透骨草、海桐皮、续断片、伸筋草和花椒7味药材，方中君药寻骨风祛风湿、通经络、止痛，海桐皮与寻骨风协同增强祛风除湿之力；臣药当归尾活血化瘀、通经止痛，凤仙透骨草祛风湿、活血散瘀；佐药续断片强筋骨、续折伤，伸筋草舒筋活络、缓解拘挛；使药花椒温通散寒、止痛之效；七味药材各具特色，能够相互配合，形成协同作用，体现了中医药治疗LDD的独特思路。
寻骨风是常用的祛风湿、通经络的药物,含有倍半萜、菲类衍生物及甾醇类等成分，能有效抑制炎症反应[10]；当归尾含挥发油、阿魏酸等成分，可治疗血瘀证，显著改善血流动力学各项指标[11]；凤仙透骨草具有祛风湿、活血、消肿、止痛等功效，其抗炎效果是成分群综合作用的结果，可降低肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β） 等炎症因子的分泌[12]；海桐皮、花椒、凤仙透骨草也具有除湿通经、散寒止痛的作用，能达到温经散寒、活血通络的功效[13]；续断片具有活血化瘀、消肿止痛的作用，是缓解腰椎间盘突出症常用药物[14]；伸筋草具有抗炎、镇痛、抗氧化等多种功效，通过抑制IL-1β、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）的表达水平发挥作用[15]。花椒在临床上主要用于抗炎与镇痛[16]。选择合适的药物配伍和熏蒸温度，并遵循医生指导，就能达到减毒增效目的。
熏洗疗法是中医传统治疗方法之一，它结合了热疗和药疗的作用，对于改善局部血液循环、促进炎症吸收、缓解疼痛等方面有显著效果[17-18]。热疗利用熏洗液产生的热量进行治疗扩张毛细血管，改善淋巴循环，增加组织的血液供应，放松肌肉，减少痉挛等。通过熏洗的方式，药物可以直接作用于病变部位，加快有害物质的代谢，减轻炎性介质的渗出，进而有效缓解局部疼痛。通过煎煮药物产生的温热蒸汽作用于腰椎局部，不仅能改善局部血液循环，促进炎症吸收，还能通过调节神经系统的反应，缓解疼痛症状。此外，中药成分可能通过皮肤渗透进入体内，发挥抗炎、抗氧化等多重作用，有助于延缓IDD进程。
椎间盘髓核组织主要由髓核细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）构成，ECM由多种成分组成，蛋白聚糖特别是AGG和COL2A1共同作用以保持椎间盘的强度和弹性，并维持其吸水能力，两者共同维持ECM的“张力-抗压”平衡，这对于维持椎间盘结构完整性至关重要[19- 20]。AGG与COL2A1的比例直接影响ECM的渗透压和机械强度。AGG通过转化生长因子β信号通路促进COL2A1合成，而COL2A1通过整合素信号增强AGG的稳定性，形成正反馈调节[21]。在LDD中，氧化应激、炎症因子（如TNF-α、IL-6）及基质降解酶（如基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13）的激活导致AGG与COL2A1的合成减少、降解增加[22-23]。AGG和COL2A1的表达水平异常与LDD的病理进程密切相关。在LDD进程中，两者的同步减少或结构异常可导致ECM崩解，引发椎间盘突出、终板硬化及椎间隙狭窄等病理改变。本研究结果显示，熏洗汤熏蒸4周后，大鼠椎间盘椎间隙相对高度及组织学退变程度均有显著改善，椎间盘髓核组织AGG和COL2A1的mRNA和蛋白水平表达显著增多，因此可以认为熏洗汤熏蒸通过提高AGG和COL2A1的表达发挥其对LDD的治疗作用。NLRP3炎性体的激活与一种名为焦亡的程序性细胞死亡形式密切相关，这种细胞死亡伴随着炎症反应的发生。当NLRP3炎性体被激活后，可以促使NP细胞发生焦亡，进而加剧椎间盘微环境炎症和基质降解。前期研究发现，通过NLRP3炎症小体活化，阻断caspase-1介导的gasdermin D剪切，减轻椎间盘细胞焦亡[24]。因此，在LDD过程中，熏洗汤熏蒸可调节NLRP3炎性小体介导的NP细胞焦亡。
本研究存在以下局限性：①本研究主要采用大鼠IDD模型进行实验，可能无法完全模拟人类LDD的复杂性和多样性，限制了研究结果对临床应用的直接指导意义；②本研究分组（n=4），每只大鼠选取四节连续的尾椎（Co5/6、6/7、7/8和8/9），实际每组有16个椎间盘（n=16），样本量虽然满足统计分析的基本要求，但仍较小；③虽然探讨了熏洗汤对AGG和COL2A1表达的影响，但对其作用机制的具体细节仍需进一步深入研究。综上所述，本研究丰富了熏洗汤在LDD治疗中的理论基础，为临床实践提供了新的思路和方法；未来研究可在更大样本量和更长时间跨度的基础上，进一步探讨熏洗汤的作用机制，为患者提供更为有效的治疗方案。
利益冲突声明：作者声明本研究不存在任何经济或非经济利益冲突。
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