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目的 基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对扎冲十三方剂中8味植物药挥发油的主要化学成分进行分析，并运用网络药理学方法探究其成分对缺血性脑卒中可能作用机制。
方法 利用GC-MS技术分析挥发油后，借助多个数据库预测分析化学成分作用靶点和疾病靶点，构建“化学成分-作用靶点”网络并由共同靶点得到蛋白质-蛋白质相互作用关系，将其可视化，根据筛选到的关键作用靶点完成基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；在Discovery Studio软件上实施关键靶点与活性成分的分子对接验证。
结果 GC-MS确认出44个化合物，占总含量的94.14%，含量最高的为丁香酚；检索出扎冲十三挥发油关于缺血性脑卒中的42个活性成分，159个潜在作用靶点；得到369个GO功能条目，126个KEGG信号通路条目，涉及癌症通路、脂质和动脉粥样硬化等。分子对接数据显示丁香酚等活性成分与缺氧诱导因子1α、基质金属蛋白酶9、信号转导与转录激活因子3等关键靶点具备较强的结合性能。
结论 该实验探究了扎冲十三挥发油通过多成分、多靶点、多途径协同用于治疗缺血性脑卒中的可能作用机制，为进一步研究扎冲十三挥发油对缺血性脑卒中的作用提供一定参考。
缺血性脑卒中也称为脑梗死，是极其普遍的一种脑血管疾病，可以说是全球范围内致残和导致死亡的最主要的因素[1]，已变成一个世界性的健康隐患。目前神经炎症、血管生成和大脑神经可塑性的病理学、生理学机制是缺血性脑卒中的研究焦点[2-3]。
近年的研究表明，扎冲十三味丸可通过抗炎、抗栓、抗凝血、抗氧化、抗细胞凋亡等机制治疗缺血性脑卒中[4-5]，在蒙医医治缺血性脑卒中的临床应用上有着不可撼动的地位，是传统且经典的蒙药药方，由麝香、木香、石菖蒲、丁香、煅磁石、肉豆蔻、甘草等13味药材组成[6]，有着祛风通窍、舒筋活血、镇静安神、除“协日乌素”的重要功效。处方组成复杂，含有8味植物药、3味矿物药及2味动物药，由于动物药和矿物药网络药理学方面的预测较少，且植物药在处方中占比较大，故而针对8味植物药进行后续研究。而丁香、石菖蒲、木香、肉豆蔻等8味植物药中蕴含非常丰富的挥发油类成分，这类成分具有抗炎、抗氧化、抗血栓、保护神经细胞等有助于治愈脑血管疾病的作用，能通过血脑屏障，进而充分发挥药物疗效[7-10]。蒙药治疗缺血性脑卒中的经典方剂，如扎冲十三味丸、额尔敦-乌日勒、白脉散[11]的组成均含有丰富的挥发油类成分，意味着方剂中的挥发油对治疗缺血性脑卒中可能具有很强的效果。目前针对挥发油治疗缺血性脑卒中的研究比较少，故本文利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对扎冲十三8味植物药的挥发油进行分离分析，将确认的化学成分进行其治疗缺血性脑卒中的网络药理学研究、分子对接验证，从而探究扎冲十三挥发油对缺血性脑卒中的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
EXPEC 5250型气相色谱－三重四级杆质谱联用仪（谱育科技聚光科技成员企业）；CLF-10C型中药粉碎机（浙江省温岭市创力药材机械厂制造）；ME204型十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利上海有限公司）。
丁香（Syzygium aromaticum.，安国市久旺药业有限公司，批号：20052415）；木香（Radix Aucklandiae.，批号：201001091）和石菖蒲（Acorus tatarinowii.，批号：201101144）购自河北济鑫堂药业有限公司；肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.，安国市荣华本草中药材有限公司，批号：C186200901）；甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.，批号：1703058）和诃子（Terminalia chebula Retz.，批号：20170818）购自安国路路通中药饮片有限公司；制草乌（Radix Aconiti Kusnezoffii Preparata.，江西博源堂药业有限公司，批号：200401）；沉香（Aquilaria agallocha Roxb.， 山西省大同市广灵县，批号：20170525）；以上药材经内蒙古医科大学渠弼教授鉴定均为正品。石油醚、无水硫酸钠、正己烷为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 挥发油提取
依照处方比例称取石菖蒲、木香、丁香、肉豆蔻、甘草、制草乌、沉香、诃子[6]，在适量蒸馏水中浸泡数分钟，向挥发油提取器中加入少许的石油醚，回流提取6 h，等待其冷却至室温，无水硫酸钠将其干燥后收集，得具有特殊气味的淡黄色透明油，置于4℃冰箱储存备用[12]。
1.2.2 GC-MS分析
1.2.2.1 气相色谱条件
采用HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm），升温程序设定为起始60℃，以10℃·min-1的速率升至90℃，保留2 min，以15℃·min-1的速率升至180℃，保留2 min，以15℃·min-1的速率升至260℃，保持10 min；进样口温度为260℃；载气为高纯氦气；体积流量为1.0 mL·min-1；进样量为1 μL；分流比为40 ∶ 1。
1.2.2.2 质谱条件
采用EI电离源，电离电压为70 eV；离子源温度为230℃；四级杆温度为 150℃；扫描范围为m/z 35~550 amu；溶剂延迟3 min。
1.2.2.3 供试品溶液的制备
取“1.2.1”项下挥发油适量，溶解于正己烷中，0.22 µm微孔滤头滤过，进样。
1.2.3 网络药理学研究
1.2.3.1 “化学成分-作用靶点网络”的构建
以GC-MS确认的化学成分为研究对象，借助PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索到化学结构并保存导入SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），检索并预测成分靶点，整理后得到成分潜在作用靶点；借助DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）以“ischemic stroke”为关键词，预测疾病靶点，整理后得到缺血性脑卒中的疾病潜在作用靶点；利用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制图网站制作成分潜在靶点与疾病作用靶点韦恩图，其中的交汇处是预测的成分和疾病的共同靶点。将活性成分和共同靶点添加到Cytoscape 3.7.2软件中，将“化学成分-作用靶点”网络可视化。
1.2.3.2 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络
将共同靶点复制粘贴至String数据库（https://cn.string-db.org/），物种选择设定为“Homo sapiens”，置信度设定为0.4，即可得到蛋白相互作用文件，将其导入到Cytoscape软件，借助拓扑指标筛选关键靶点，并构建出PPI网络图。
1.2.3.3 富集分析
把关键靶点输入到DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）中作基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，整理后借助R软件的clusterProfiler包可视化。
1.2.4 分子对接验证
将关键靶点的蛋白质数据库（PDB）ID键入至PDB数据库（http://www.rcsb.org/）并下载PDB格式，利用PubChem数据库下载关键活性成分3D结构的sdf文件，将两者文件导入 Discovery Studio 2019软件中，采用Libdock对接方法来进行分子对接验证。
2 结果
2.1 GC-MS成分分析
挥发油GC色谱图见图1，通过检索NIST-POS.dbc 谱库、质谱分析及核对文献[13-23]，共识别出44个化学成分，占总量的94.14%，含量最高的为丁香酚（10.97%），见表1。
2.2 网络药理学分析
2.2.1 “化学成分-作用靶点网络”的构建
将预测到的588个成分潜在作用靶点、1 159个疾病潜在作用靶点绘制韦恩图，见图2，交汇处是成分与疾病的共同靶点共159个。借助Cytoscape 软件构建出42个活性成分与159个潜在作用靶点的“化学成分-作用靶点”的网络图，可视化分析见图3。拓扑分析整理出34个度（degree）值超过2倍均值（平均度值=9.35）的活性成分，见表2。结合缺血性脑卒中的现有研究报道[24 -27]，α-蒎烯、丁香酚等8个成分可能是扎冲十三挥发油治疗缺血性脑卒中的关键活性成分。
2.2.2 构建PPI蛋白互作网络
采用Cytoscape 软件中的cytohubba插件将159个潜在作用靶点的PPI蛋白互作数据进行拓扑分析，得到degree值相对较高的30个关键靶点并将其可视化，见表3和图4。degree值越大，该节点则越大，颜色也越深，反之亦然。其中肿瘤坏死因子（TNF）、表皮生长因子受体（EGFR）、转录因子（JUN）、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤蛋白P53（TP53）、白蛋白（ALB）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、缺氧诱导因子1α（HIF1A）、胱天蛋白酶3（CASP3）、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、白细胞介素6（IL-6）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）等与其他蛋白关系密切。
2.2.3 富集分析
将30个关键靶点输入DAVID数据库完成GO功能富集分析，筛选出P＜0.05的条目，得到290个生物过程、28个细胞组分、51个分子功能，共369个GO功能条目，均以排名前10的条目制图，见图5。结果提示，靶点重点集中在血管生成、凋亡过程的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调控和细胞对活性氧的反应等生物过程（BP）；着重集中在胞质、核染色质、核浆等细胞组分（CC）；着重起到转录调控区序列特异性DNA结合、转录因子结合、酶结合等分子功能（MF）。
采用DAVID数据库完成KEGG信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的条目，得到126条信号通路，以排名前20的条目制图，见图6。其重点涉及的通路有肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、脂质和动脉粥样硬化、癌症通路等。
2.3 分子对接结果
利用度值靠前的TNF、HIF1A、VEGFA、TP53、ALB、CASP3、PTGS2、JUN、MMP-9、IL-6、EGFR、STAT3关键靶点与关键活性成分做分子对接，Libdock score越高，反映出分子对接结合力越强，对接结果见表4。除α-蒎烯与关键靶点、TNF与活性成分对接情况欠佳外，其他大多数成分都能与靶点蛋白形成较好的对接，这其中MMP-9与甲基丁香酚、肉豆蔻醚、丁香酚、α-细辛醚，STAT3与肉豆蔻醚、α-细辛醚的Libdock score相对较高，反映出分子结合力很强。对接效果图见图7。
3 讨论
动物实验显示，扎冲十三味丸可通过作用于TNF-α等炎症因子发挥抗炎作用减轻炎症反应对脑组织的损伤[28]；通过抗凝血作用，延长脑部血栓的形成时间[29]；通过调节神经细胞凋亡，降低缺血脑组织细胞凋亡百分率，对脑组织缺血损伤有保护作用[30]。扎冲十三味丸中含有大量的丁香酚、β-细辛醚、去氢木香内酯等挥发性成分[31]。GC-MS分析表明，扎冲十三挥发油中主要含有丁香酚、甲基丁香酚、β-细辛醚、α-细辛醚、去氢木香内酯、肉豆蔻醚等成分，对这些成分进行网络药理学成分靶点预测，查找到活性成分42个、与缺血性脑卒中疾病共同的潜在作用靶点159个，多数活性成分都与治疗缺血性脑卒中相关，可起到神经保护作用，其中丁香酚含量最大。实验研究表明，丁香酚通过发挥抗氧化、抗炎等作用，能显著减轻脑缺血/再灌注的神经系统功能受损，能够提供很好的神经保护作用[24]；α-细辛醚通过改善神经功能，减少梗塞体积，从而减轻缺血性脑卒中的症状[25]；β-细辛醚通过抑制TNF-α在划痕损伤小鼠神经细胞中的表达，调节神经元凋亡和促进轴突再生，能够降低局灶性脑缺血大鼠脑组织水分含量，减少脑梗死面积，能使海马神经元存活率上升，对缺血性脑损伤产生保护作用[26-27]；芳樟醇可减少炎症，并对小胶质细胞产生有效作用[32]；甲基丁香酚在大鼠脑缺血模型中，通过抑制自由基的产生和一氧化氮产生，降低了诱导一氧化氮合酶的蛋白质表达[33]。α-蒎烯通过减弱神经炎症和抑制细胞凋亡，在缺血性脑卒中发病中发挥神经保护作用[34]。
PPI蛋白互作分析筛选出MMP-9、TNF、HIF1A、STAT3等30个关键靶点，多数与血管再生、炎症反应、神经保护作用相关。由GO功能及KEGG通路富集分析可知，扎冲十三挥发油主要参与血管生成、凋亡过程的正调控以及细胞对活性氧的反应、酶结合、转录因子结合等生物过程和发挥分子功能，其主要参与癌症通路、调控脂质和动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、乙型肝炎、IL-17信号通路、c型凝集素受体信号通路等通路。VEGFA属于VEGF家族基因，能够促进血管内皮细胞生成与增殖，进而保护神经，诱导缺血损伤的脑血管再生[35-36]；MMP-9参与到早期的脑缺血再灌注损伤后脑水肿的形成及再灌注损伤，调节MMP-9水平对组织形成、脑神经元网络再塑造和血脑屏障完整性极其重要，发挥了脑神经保护的功能[37]；HIF1A可诱导侧支循环从而减少大鼠脑梗死症状[38]；TNF是动脉粥样硬化炎症过程中的重要细胞因子，是神经炎症极其重要的介质，而炎症反应是病理生理过程的重要环节，可通过降低炎症细胞因子TNF-α水平，进而抑制神经变性和炎症损伤，改善脑组织局部环境[39-40]；可通过影响脑缺血再灌注损伤区域的STAT3的表达发挥神经保护作用[41]。研究发现，VEGF、MMP-9、STAT3的表达程度与缺血性脑卒中症状的严重程度及预后效果有着一定的关系[42-43]。实验表明，动脉粥样硬化是导致缺血性脑部疾病的重要原因，动脉粥样硬化通路通过调节包括VEFG、MMP-9等因子水平，影响致氧化应激和炎症反应的发生，发挥抗凝血作用，从而减少血栓的形成[44-45]。分子对接除结果表明除α-蒎烯与关键靶点对接效果较差外，其余关键活性成分与关键靶点呈现出相对较好的对接效果。
结果表明，扎冲十三挥发油中丁香酚、β-细辛醚、α-细辛醚、甲基丁香酚等活性成分可能作用于VEGFA、MMP-9、TNF、STAT3、HIF1A、PTGS2等关键靶点，通过参与凋亡过程的调控、血管生成等生物过程，在参与调控肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、脂质和动脉粥样硬化等多个通路中，发挥抗炎、抗血栓、抗氧化作用、调节细胞凋亡、促进血管再生等，起到脑神经保护作用，达到防治缺血性脑卒中的目的。扎冲十三挥发油中的不同活性成分通过不同的靶点作用于完全相同或各不相同的信号传导通路，这也就意味着扎冲十三挥发油的靶点在治疗疾病上有着协同起效作用，从而更好的发挥药物疗效作用；而扎冲十三挥发油中的活性成分也并不都是有效的药物成分，也就是说并不一定都能够很好的发挥治疗疾病的功效。阐明扎冲十三挥发油治疗缺血性脑卒中是在多成分-多靶点-多信号通路的复杂作用机制下发挥疗效的。
综上所述，本文借助GC-MS技术、网络药理学、分子对接，初步探究了扎冲十三挥发油治疗缺血性脑卒中的化学成分及可能作用机制，揭示成分、靶点、疾病、通路之间复杂的关系，提示扎冲十三挥发油通过多成分、多靶点、多通路协同发挥治疗缺血性脑卒中的作用，旨在为扎冲十三挥发油治疗缺血性脑卒中的后续实验研究奠定良好基础。
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