目的  探讨金银花含药血清对脂多糖（LPS）诱导的人牙周膜细胞（HPDLCs）活性及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、白细胞介素1β（IL^-1β）通路的影响。

方法  将20只大鼠按随机数字表法分为对照组（生理盐水）和金银花组（5.0 g·kg^-1），每组10只，灌胃给药，1次/d，持续14 d。将HPDLCs分为对照组（空白血清培养）、LPS组（10 μg·mL^-1 LPS+空白血清培养）、金银花低浓度（HPDLCs+10 μg·mL^-1 LPS +75 μL空白血清培养+75 μL 5%金银花含药血清）、中浓度（HPDLCs+10 μg·mL^-1 LPS+75 μL空白血清培养+75 μL 10%金银花含药血清）、高浓度（HPDLCs+10 μg·mL^-1 LPS+75 μL空白血清培养+75 μL 20%金银花含药血清）组。MTT检测HPDLCs细胞增殖率，Transwell小室检测HPDLCs细胞迁移，流式细胞仪检测HPDLCs细胞凋亡率，PCR检测HPDLCs中IL^-1β、NLRP3 mRNA的相对表达；Western blotting法检测各组HPDLCs中IL^-1β、NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）蛋白表达。

结果  与对照组比较，LPS组HPDLCs在24，48，72 h的细胞增殖率及细胞迁移数量显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率、IL^-1β、NLRP3 mRNA和IL^-1β、NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与LPS组比较，金银花各剂量组HPDLCs在24，48，72 h的细胞增殖率和细胞迁移数量显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率、IL^-1β、NLRP3 mRNA和IL^-1β、NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

结论  金银花对改善LPS诱导的HPDLCs凋亡和促进HPDLCs的增殖和迁移具有一定作用，其机制可能与调控NLRP3、IL^-1β及Caspase-1表达水平相关。

牙周炎是临床常见的口腔疾病之一，是由细菌引起的一种慢性非特异性炎症，早期可出现牙龈出血、炎症，后期牙龈和牙槽骨萎缩性改变。在多种病原微生物及其代谢产物的刺激下可破坏牙周组织并影响牙周膜细胞生长最终导致牙齿松动脱落[1]。人牙周膜细胞（human periodontal ligamentcells, HPDLCs）是牙周膜中主要组成部分，可参与牙周组织形成再生，其分裂和凋亡在牙周组织的重建和破坏中具有重要作用[2]。炎症复合体是胞质内模式识别受体家族成员之一，其中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）为NLR3家族中的炎症复合体，可通过效应分子白细胞介素1β（IL^-1β）发挥作用，还可调控炎症反应及细胞凋亡的激活[3]。IL^-1β是一种促炎因子，其水平与牙周炎严重程度有密切关系[4]。因此，抑制炎症反应，提高HPDLCs的功能特性对牙周组织的治疗有重要的作用。中药血清药理学是将中药或中药复方给动物灌服一定时间后通过采集血液、分离血清，以含药血清代替中药粗提物作为药物源加入离体反应系统中，从而研究其药理作用的一种半体内实验方法[5]。近年来，越来越多的专家应用该方法来研究中药的药理作用，以研究其在多种疾病治疗中的应用。金银花作为我国传统中药，一般以干燥花蕾或带初开的花入药，性寒，味甘，具有清热解毒、热病泻痢等作用，对外感风热、温病发热等有较好的治疗作用[6]。金银花功能性成分丰富，目前从金银花中分离得到的功能性成分主要包括有机酸类（绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等）、黄酮类（木犀草素、芦丁等）、三萜皂苷类（忍冬苦苷等）等，均有较强的抗菌抗炎的作用[7]。但关于金银花对脂多糖（lipopolysa-ccharide, LPS）诱导的HPDLCs活性相关研究目前较少，因此本文通过探讨金银花含药血清对LPS诱导HPDLCs活性及NLRP3、IL^-1β通路作用机制的研究，意在为临床金银花用于牙周疾病的治疗提供基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

CP-ST50A/CP-ST100A/CP-ST200A型二氧化碳培养箱（长沙长锦科技有限公司）；DYCZ-24DH型蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；BX53型奥林巴斯型生物显微镜（日本Olympus公司）；BriCyte E6型流式细胞仪（迈瑞医疗）；KUBOTAKA-2200型离心机（北京东迅天地医疗仪器有限公司）；SpectraMax iD3酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）。

金银花（产地：山东平邑，批号：22864）由我院中药局采购，经山东医科大学中药系专家、主治医师周荣静鉴定，为灰毡毛忍冬Lonicera macreanthoides Hand·-Mazz·的干燥花蕾，样品中绿原酸含量符合2020版中国药典山银花项下规定；LPS（北京索莱宝科技有限公司，批号：L8880，纯度≥99%）；生理盐水（湖南正清制药集团股份有限公司，批号：0803420）；戊巴比妥钠（菏泽市立医院，批号：20150901）；一抗兔抗鼠IL-1β、NLRP3、Caspase-1多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号：3033、2859、2635）；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗（美国Jackson公司，批号：111-035-003）；胎牛血清（上海江林生物科技，货号：04-001-1ACS）；胰蛋白酶（上海今品化学技术有限公司，批号：9002-07-7）；DEME培养基（北京义翘神州科技股份有限公司，货号：M293TII）；MTT试剂盒（武汉时胜生物科技有限公司，货号：C0009）；Transwell小室（北京明阳科华生物科技有限公司，批号：354480）；DAB显色试剂盒（博士德生物工程有限公司，批号：AR1022）。

1.2 细胞

HPDLCs（上海弘顺生物科技有限公司，货号：GD-C9918621）。

1.3 动物

20只SD大鼠，雄性，月龄4~6个月，体重180~220 g，购自简阳达硕动物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（京）：2020-0076，每个笼内饲养5只大鼠，笼内自由活动，标准大鼠饲料喂食，自由饮食饮水，室内温度控制在20℃，相对湿度为60%左右，无死亡现象，适应环境7 d避免外界刺激，所有大鼠实验前均生长良好，按照《实验动物管理条例》规定开始进行实验，实验方案经我院动物伦理委员会批准（批准号：2023052）。

1.4 方法

1.4.1 药物提取

参考文献[8]将金银花用10倍量的100℃蒸馏水提取3次，3 h/次，合并3次提取液，用纱布过滤，冷冻干燥即得。临用前用蒸馏水配制成金银花生药量25 g·kg^-1。

1.4.2 分组与含药血清的制备

20只大鼠按随机数字表法将其分为对照（CON，生理盐水）组和金银花组（5.0 g·kg-1），每组10只。给药前对CON组大鼠血清进行采集作为空白血清；依据文献[9]应用动物实验给药剂量换算公式“大鼠用药剂量（mg·kg-1）=6.25×人用药剂量（mg·kg-1）”换算，将金银花按照5.0 g·kg-1给予金银花组大鼠进行灌胃，依据文献[10]每日给药1次，共干预14 d。CON组以同体积生理盐水灌胃，于末次给药次日清晨以10%戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后经大鼠腹腔主动脉取血3 mL，4℃条件下静止4 h，1 700×g离心30 min，保留血清，56℃水浴灭活，除菌过滤后，-20℃条件下密封冷藏备用，作为含药血清。

1.4.3 含药血清培养

取第3代HPDLCs，用2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化后以每孔1×10⁶个细胞接种于6孔板，37℃条件下CO₂培养箱中培养，细胞贴壁后更新新鲜的无血清DEME培养基中继续培养。培养1 d后，弃上清，将HPDLCs分为5组：CON组（150 μL 空白血清培养）、LPS组（10 μg·mL^-1 LPS+150 μL空白血清培养）、金银花低浓度（LCH，10 μg·mL^-1 LPS+75 μL空白血清+75 μL 5%金银花含药血清培养）、中浓度（MCH，10 μg·mL^-1 LPS+75 μL 空白血清+75 μL 10%金银花含药血清培养）、高浓度（HCH，10 μg·mL^-1  LPS+75 μL 空白血清+75 μL 20%金银花含药血清培养）组[11]。

1.4.4 MTT检测HPDLCs细胞增殖率

将对数生长期的HPDLCs更换含有1%胎牛血清培养基进行同步消化。吸去原培养液，每个浓度6个复孔，每孔细胞数为1×10⁴个细胞，均加入5 mg·mL^-1 的MTT溶液20 μL，培养24 h，然后吸弃培养液，再在每个孔中加入50 μL DMSO，摇匀后于酶标仪560 nm处测吸光度（A）值，并计算细胞增殖率。

1.4.5 Transwell小室检测HPDLCs细胞迁移

各组HPDLCs接种、数量、悬液制备同上，小室加入100 μL细胞悬液，将Transwell小室放入24孔板中，下室加入含30% FBS的培养液800 μL，置于培养箱中孵育12 h；用PBS对Transwell小室连续清洗2次，采用4%多聚甲醛在正常室温下固定25 min，然后用0.4%结晶紫染液染色，PBS清洗，去掉多余染料，显微镜下观察拍照。棉签吸掉多余水分，用1%十二烷基硫酸钠（SDS）500 μL溶解细胞30 min。完全溶解后，取100 μL细胞裂解液，放入96孔板细胞培养板中，570 nm酶标仪测定A值。

1.4.6 流式细胞术检测HPDLCs细胞凋亡率

将各组HPDLCs密度为1.2×10⁶个/L接种于6孔板中，0.25%胰蛋白酶消化后，加入无牛血清培养基过夜，24 h后，PBS洗涤1次，100 μL接种于5 mL流式试管中，5 μL的AnnexinⅤ与5 μL PI混合后染色，无光条件下孵育15 min后注入400 μL 结合缓冲液混匀，洗涤3次，采用流式细胞仪检测HPDLCs细胞凋亡情况。

1.4.7 PCR检测HPDLCs中IL-1β、NLRP3表达

将各组HPDLCs取出，进行研磨，用Trizol进行总RNA的提取，逆转录参照说明书进行；将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验，内参采用β-actin引物，所有反应严格按照反应的条件进行扩增：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火和延伸1 min，共40个循环。采用 2^-ΔΔCt计算其基因相对表达量，平均值计算Ct值，引物由上海生工合成，引物序列见表1。

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  表格1 引物序列

  Table 1.Primer sequence

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1.4.8 Western blotting法检测各组HPDLCs中IL-1β、NLRP3、Caspase-1表达

将各组HPDLCs加入裂解液，冰盒中裂解约30 min，期间每10 min振荡１次，使其充分裂解，1 200×g离心15 min，吸取上清即为蛋白样品，将蛋白样品与上样缓冲液按照5 ∶ 1的比例混合，煮沸15 min，配制10%~15%的SDS-PAGE 分离胶和 5% 的浓缩胶，上样量 400 mg（20 μL），凝胶电泳分离蛋白后转移到PVDF膜上，封闭液封闭1 h，一抗IL^-1β（1 ∶ 1 000）、NLRP3（1 ∶ 1 000）、Caspase-1（1 ∶ 1 000），4℃孵育，过夜，洗涤3次，每次15 min；室温摇床孵育二抗（1 ∶ 3 000）1 h，洗涤3次，每次15 min；ECL显影，以GAPDH作为内参，计算IL^-1β、NLRP3及Caspase-1相对表达量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，多组完全随机设计资料的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；对符合正态分布且满足方差齐性的重复测量资料进行分析，若满足Mauchly's球形假设检验则采用两因素方差分析；若不满足球形假设时，采用Greenhouse-Geisser方法校正。如果自变量之间不存在交互效应，着重分析主效应；如果自变量之间存在交互效应，着重分析简单主效应，并使用 Bonferroni法进行多重比较。双侧检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 各组HPDLCs细胞增殖率比较

与CON组比较，LPS组HPDLCs细胞在24，48，72 h的细胞增殖率显著降低（P＜0.05）；与LPS组比较，金银花各剂量组HPDLCs细胞增殖率显著升高（P＜0.05）；金银花各剂量间细胞增殖率差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量组的细胞增殖率升高最多。结果见表2。

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  表格2 各组HPDLCs细胞增殖率（%，x±s，n=6）

  Table 2.Cell proliferation rate of HPDLCs in each group (%,x±s , n=6)

  注：与CON组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP<0.05；与LCH组比较，cP＜0.05；与MCH组比较，dP＜0.05

  

2.2 各组HPDLCs细胞迁移数量比较

与CON组比较，LPS组HPDLCs迁移数量显著降低（P＜0.05）；与LPS组比较，金银花各剂量组HPDLCs细胞迁移数量显著升高（P＜0.05）；金银花各剂量间细胞迁移数量差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量组的细胞迁移数量最多。结果见图1、图2。

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  图1 各组HPDLCs细胞迁移显微图（400×）

  Figure 1.HPDLCs cell migration micrograph of each group (400×)

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  图2 各组HPDLCs迁移数量（n=6）

  Figure 2.HPDLCs migration in each group (n=6)

  注：与HEA组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05；与LCH组比较，cP＜0.05；与MCH组比较，dP＜0.05

  

2.3 各组HPDLCs细胞凋亡率比较

与CON组比较，LPS组HPDLCs细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）；与LPS组比较，金银花各剂量组HPDLCs细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；金银花各剂量间细胞凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量组的细胞凋亡率下降最明显。结果见图3、图4。

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  图3 流式细胞检测图

  Figure 3.Flow cytometry

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  图4 各组HPDLCs细胞凋亡率比较（n=6）

  Figure 4.Comparison of apoptosis rate of HPDLCs in each group (n=6)

  注：与HEA组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05；与LCH组比较，cP＜0.05；与MCH组比较，dP＜0.05

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2.4 各组HPDLCs中IL-1β、NLRP3 mRNA的表达比较

与CON组比较，LPS组HPDLCs中IL^-1β、NLRP3 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与LPS组比较，金银花各剂量组HPDLCs细胞中IL^-1β、NLRP3 mRNA表达显著降低（P＜0.05）；金银花各剂量间HPDLCs中IL^-1β、NLRP3 mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量组IL^-1β、NLRP3 mRNA表达下降最明显。结果见表3。

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  表格3 各组HPDLCs中IL-1β、NLRP3 mRNA表达（x±s，n=6）

  Table 3.mRNA expression of IL-1β and NLRP3 in HPDLCs of each group (x±s, n=6)

  注：与CON组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05；与LCH组比较，cP＜0.05；与MCH组比较，dP＜0.05

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2.5 各组HPDLCs中IL-1β、NLRP3、Caspase-1的表达

与CON组比较，LPS组HPDLCs中IL^-1β、NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与LPS组比较，金银花各剂量组HPDLCs中IL^-1β、NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著降低（P＜0.05）；金银花各剂量间HPDLCs中IL^-1β、NLRP3、Caspase-1蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量组IL^-1β、NLRP3、Caspase-1的蛋白表达下降最明显。结果见图5和表4。

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  图5 IL-1β、NLRP3、Caspase-1蛋白表达条带图

  Figure 5.Expression bands of IL-1β, NLRP3 and Caspase-1 proteins

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  表格4 各组HPDLCs中IL-1β、NLRP3、Caspase-1蛋白表达（x±s，n=6）

  Table 4.Expressions of IL-1β, NLRP3 and Caspase-1 in HPDLCs of each group (x±s, n=6)

  注：与CON组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05；与LCH组比较，cP＜0.05；与MCH组比较，dP＜0.05

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3 讨论

近年来，金银花在疾病中的治疗效果越来越被国内外学者所肯定，有学者在进行急性胰腺炎肺损伤大鼠的研究中发现，经金银花的干预治疗后，大鼠肺组织中的IL-β、IL^-18的表达水平显著降低，并肯定了其抗炎功效[12]。HPDLCs经过LPS刺激后NLRP3/IL^-1β信号通路被激活，并可能通过NLRP3炎性小体介导的炎症反应加快细胞凋亡来参与牙周炎的发生发展。国外学者[13]研究发现，LPS是革兰阴性厌氧菌代谢产物的主要成分，可通过破坏牙龈结合上皮进入牙周组织，与HPDLCs中的磷脂相互作用进而破坏细胞膜结构，影响细胞增殖分裂并加重局部炎症反应。本研究中，经金银花干预后HPDLCs中IL^-1β、NLRP3、Caspase-1显著降低，表明金银花对抑制NLRP3/IL^-1β通路的表达具有一定影响。在牙周炎中，IL^-1β作为炎症调节的始动因素和调节剂，能刺激干细胞生长因子的释放，激活一系列信号分子，使上皮细胞根向增殖并形成牙周袋从而破坏牙周组织[14]。经研究，NLRP3炎性小体激活后炎症反应和细胞凋亡过程均会发生相应变化[15]。在牙周组织损伤中，NLRP3炎性小体激活所造成的Caspase-1大量活化能够使炎症细胞因子IL^-1β、IL^-18的前体裂解液变为有活性的成熟体，并通过IL^-1β、IL^-18促炎的生物学活性来招募多种炎症细胞从而对牙周组织产生影响。王芳等[16]研究发现，金银花中的绿原酸、咖啡酸等多种酚酸类化合物对LPS诱导的肝损伤小鼠、巨噬细胞释放的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL^-1β等炎症因子均具有不同程度的抑制作用。木犀草素是金银花主要成分之一，李苑荟等[17]通过建立牙周炎大鼠模型进行研究发现，经过木犀草素干预后大鼠牙周组织中的NLRP3、IL^-1β的表达水平明显下降，说明木犀草素可以抑制NLRP3/IL^-1β信号通路，进而改善牙周组织的炎症。本研究结果与之类似。由此推测，金银花也可通过调控NLRP3/IL^-1β信号通路，抑制牙周膜细胞的炎性表达。

细胞增殖是细胞生物学特性的重要体现，通过细胞增殖可促进组织的再生修复与改建[18]。经研究，牙周膜细胞通过分化、增殖不仅可维持牙周组织的正常代谢，同时也能修复缺损的牙周组织，维持牙周健康平衡。细胞凋亡属于基本的细胞生物学现象，是由一系列酶参与并由基因所控制的高度有序的细胞死亡过程[19]。本研究结果显示，经过金银花含药血清干预后，发现金银花对促进HPDLCs细胞增殖、迁移及抑制HPDLCs细胞凋亡具有一定影响。现代药理学研究发现，金银花除了具有解热抗炎、抗菌作用之外，成分中的绿原酸类物质还可以有效清除自由基及抗氧化作用，并可通过抑制活性氧簇产生和Caspase-1的凋亡途径激活，进而保护心肌细胞免受损伤、抗心肌细胞的凋亡[20]。针对中药及其复方化学成分多样化的特点，用含药血清代替煎剂或粗提物进行体外实验，克服了中药粗制剂直接进行体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验。未来可以研究金银花含药血清对HPDLCs等信号通路的影响，及在调节细胞分化、增殖和凋亡的过程中的作用。并根据金银花的药理特性，研发相关治疗药物，在调节各方面机能的同时实现减少抗菌药物的使用，达到未病先防、中西结合，为人类提供更为安全有价值的治疗成果。

综上所述，金银花可在一定程度上降低LPS诱导的HPDLCs凋亡，并促进HPDLCs的增殖和迁移，其机制可能与调控NLRP3、IL^-1β及Caspase-1相关。由于现阶段对于金银花含药血清对牙周膜细胞活性的参考研究较少，且本次实验经费有限、研究样本量较少，本次研究仍存在一定不足，日后将不断完善和丰富实验内容。

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