目的  探究天然化合物槐角苷（SOP）对肝脏缺血-再灌注损伤（HIRI）的保护作用及其分子机制，为开发HIRI治疗药物提供依据。

方法  建立体外肝细胞缺氧/复氧（H/R）模型及小鼠体内HIRI模型。体外实验采用CCK-8检测细胞活力，RT-qPCR和Western blot（WB）分析炎症因子及相关蛋白。体内实验测定小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）活性，结合H&E染色和免疫荧光染色评估肝组织病理损伤及细胞凋亡。运用分子对接预测SOP与腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）的相互作用，并通过AMPK抑制剂（Compound C）验证机制。

结果  SOP在体外可显著增强H/R诱导的肝细胞活性并抑制炎症因子释放，在小鼠体内能降低血清ALT、AST水平，减轻肝组织炎症浸润和细胞凋亡。机制研究表明，SOP在体内外均能促进AMPK磷酸化，分子对接分析显示其可通过氢键与AMPK稳定结合，且AMPK抑制剂可逆转SOP的保护作用，证实AMPK是SOP发挥效应的关键靶点。

结论  SOP可通过靶向激活AMPK抑制 HIRI中的炎症与凋亡，为基于天然产物的药物开发和靶向治疗提供了新策略。

肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是部分肝切除与肝移植术中常见的病理生理现象，其机制为缺血器官因血液供应不足导致缺氧、细胞代谢紊乱，而血流恢复后氧与营养供应仍不足，同时伴随代谢副产物蓄积[1]。HIRI多发生于需肝脏离断的手术中，是导致手术失败及患者死亡的原因之一[2-5]。早期缺血状态会引起三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）耗竭及毒性代谢物堆积，直接导致肝细胞损伤并诱发凋亡与坏死，释放危险模式信号分子激活库普弗细胞和中性粒细胞，引发炎症性损伤；再灌注阶段，活化的免疫细胞通过释放细胞因子、趋化因子及细胞黏附分子，驱动中性粒细胞和淋巴细胞浸润肝组织，从而加剧肝细胞损伤[6-7]。同时活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量生成一方面通过激活氧化还原调控的c-Jun氨基末端激酶1/2（c-Jun N-terminal kinase 1/2，JNK1/2）和核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路，破坏机体氧化还原稳态，从而诱发炎症反应[1, 8]，另一方面ROS可扩散进入肝细胞，引起线粒体功能障碍，进一步导致细胞内钙离子浓度失衡并最终启动细胞凋亡过程[9]。因此，HIRI实质上是由能量代谢障碍、氧化应激和炎症反应相互耦合所驱动的复杂病理过程。尽管相关机制研究已有进展，但临床上仍缺乏有效的靶向性治疗手段。

研究[10]表明，腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是HIRI的关键调控因子。AMPK信号通路通过调节炎症、凋亡及氧化应激减轻肝脏缺血再灌注损伤[11]。AMPK的激活可促进ATP生成，以代偿缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）期间的能量不足，如增强葡萄糖摄取、糖酵解及脂肪酸氧化[12]。此外，AMPK激活还能够抑制细胞凋亡[13-15]。临床上针对HIRI现有治疗以抗炎、抗氧化、改善微循环等支持性疗法为主[16-17]，缺乏针对患者的个体化治疗方案，有效治疗方法和药物仍然有限。因此，AMPK不仅是解释HIRI病理过程的重要分子节点，也为寻找潜在干预药物提供了可行靶点。

近年来，天然药物在疾病防治领域展现出广阔的应用前景。作为传统中药的重要来源，豆科植物槐树Sophora japonica L.的干燥花蕾槐米和成熟果实槐角具有悠久的药用历史。研究表明，从槐树种子中提取的异黄酮苷类活性成分槐角苷（sophoricoside，SOP）具有广泛的药理活性，包括显著的抗肿瘤[18]、抗过敏[19]及抗炎作用[20]等。在机制研究方面，Wu等[21]通过建立脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型，发现SOP预处理可改善微血管通透性，抑制中性粒细胞浸润，并下调肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子的表达，显著减轻肺组织病理损伤。此外，SOP还能够通过调节Th1/Th2免疫平衡，抑制IgE介导的过敏反应，从而有效缓解气道高反应性和哮喘症状。值得注意的是，最新研究发现SOP还可通过激活AMPK/mTORC1信号通路，提升心肌细胞自噬水平，进而改善压力负荷诱导的心肌肥厚[22]。综上，SOP具有调控免疫反应、炎症过程及AMPK信号通路等方面的作用，可能成为缓解HIRI的潜在干预剂。

本研究旨在探究天然化合物SOP对HIRI的保护作用及其分子机制。通过建立体外肝细胞H/R模型及小鼠体内HIRI模型，结合细胞活力检测、炎症因子分析、血清酶学测定、组织病理学评估及分子对接实验，对SOP在HIRI过程中的肝细胞损伤、炎症反应及细胞凋亡进行了系统研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 药品与试剂

槐角苷（Lot: 524376）和Compound C（Lot: 865492）购于美国生物活性分子大师公司（MedChemExpress）；DMEM高糖培养基（Lot: WH0124E132）购于武汉普诺赛生物科技有限公司；DMEM无糖培养基（ Lot: 28546631）购于美国赛默飞世尔科技有限公司（ThermoFisher）；胎牛血清（Lot: FBS-S010918）购于新西兰NEWZERUM公司；青霉素-链霉素溶液（Lot: BLCK017E0817）购于江西惠康科技有限公司；p-IKKβ（Lot: 1）、IKKβ（Lot: 3）、IKβα（Lot: 2）、p-p65（Lot: 4）、p65（Lot: 3）、Bad（Lot: 3）、Bcl2（Lot: 4）、Bax（Lot: 4）、p-AMPK（Lot: 2）、AMPK（Lot: 3）、GAPDH（Lot: 4）蛋白一抗均购于美国CST公司（Cell Signaling Technology）；WB二抗（Lot: 152551、152534）购于美国杰克森公司（Jackson）；CCK-8试剂盒（Lot: DV651）购于日本同仁化学研究所（DOJINDO）；苏木精染液（Lot: CR2024211）购于武汉塞维尔生物科技有限公司；伊红染液（Lot: 2024106）购于上海贝斯昂科生物科技有限公司；CD11b一抗（Lot: B0S6695BP3337）购于武汉博士得生物技术有限公司；CD11b二抗（Lot:  2284593）购于美国赛默飞世尔科技有限公司（ThermoFisher）；TUNEL试剂盒（Lot: 73671587）购于瑞士罗氏公司（ROCHE）；DAPI染色液（Lot: D3619-PI19B）购于美国南方生物科技公司（SouthernBiotech）。

1.1.2 仪器

蠕动泵（HY-N0423）购于英国兰格恒流泵有限公司（LongerPump）；常温离心机（75009880）、二氧化碳培养箱（371GP）、4 ℃离心机（75002543）购于美国赛默飞世尔科技有限公司（ThermoFisher）；多功能酶标仪（SpectraMax i3X）购于美国美谷分子仪器公司（Molecular Device）；PCR仪（1861096）购于美国伯乐公司（BIO-RAD）；实时荧光定量PCR仪（LightCycle 480 Instrument II）购于瑞士罗氏公司（Roche）；全自动生化分析仪（ADVIA 2400）购于德国西门子公司（SIMENS）。

1.2 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，体重24~27 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0006，饲养及处理均遵循《实验动物护理和使用指南》。所有动物实验方案均通过赣南创新与转化医学研究院实验动物使用与管理委员会审查和批准，伦理审查受理号为GIMI-K2024150（中国赣州）。实验动物均饲养于无特定病原体（SPF）级动物房，环境温度控制在（24±2） ℃，湿度45%~65%，12 h光照 /黑暗循环，期间自由摄食饮水。实验过程中严格遵循动物福利原则。

1.3 动物实验

1.3.1 动物分组

雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，体重24~27 g）共50只，随机分为5组（每组10只）：Sham组，术前腹腔注射等体积二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），仅行开腹术后关闭腹腔，不实施I/R处理；0-I/R组，术前腹腔注射等体积DMSO，随后实施I/R手术；L-I/R组，术前1  h腹腔注射低剂量SOP（30 mg·kg^-1），随后实施I/R手术；M-I/R组，术前1 h腹腔注射中剂量SOP（60 mg·kg^-1），随后实施I/R手术；H-I/R组：术前1 h腹腔注射高剂量SOP（90 mg·kg^-1），随后实施I/R手术。SOP剂量范围参考文献[23-26]确定。

1.3.2 肝脏I/R模型建立

小鼠采用3%戊巴比妥钠（80 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰卧位，四肢以医用胶带固定于手术台。术区常规备皮，并依次用碘伏和75%乙醇消毒。参照Tsung等[27]的方法建立肝脏I/R模型：在腹正中切开约1 cm切口，分离肝左叶及中叶的门静脉和肝动脉分支，使用无创血管夹阻断血流，造成约70%的肝组织缺血。阻断30 s后，缺血叶肝脏由红润转为苍白，与未阻断的右叶形成鲜明对比，提示阻断成功。随后暂时关闭切口，并在术中持续使用37 ℃恒温垫维持体温。假手术组除不实施血管阻断外，其余操作完全相同。

持续缺血60 min后，重新开腹并移除血管夹恢复血流。肉眼可见缺血区肝脏在30 s内由苍白转为鲜红，提示再灌注成功。术后待小鼠清醒后送回饲养室，持续观察其生存状态。再灌注3 h后，采用过量戊巴比妥钠（120 mg·kg^-1）处死小鼠并取材。采集的血液样本室温静置2 h后，于4 ℃、离心（1 500×g）10 min分离血清，80 ℃保存。另取肝左叶组织用于病理学检测，肝中叶组织用于分子生物学分析。

1.3.3 肝功能检测

模型建立完成后，取各组血清样本进行检测。其中肝脏I/R组血清用生理盐水稀释15倍，假手术组血清未经稀释处理。采用生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.3.4 H&E染色

取肝左叶组织置于10%中性甲醛水溶液固定缓冲液固定72 h，经梯度脱水、石蜡包埋后制成5 μm厚切片。采用H&E染色观察肝组织形态学改变。使用Image Pro Plus软件分析并定量组织坏死区域面积，每只小鼠至少选取5个视野计算坏死区域占组织切片总面积的百分比。

1.3.5 免疫荧光染色

CD11b免疫荧光染色：肝组织切片经乙二胺四乙酸高温修复抗原后，用10%牛血清蛋白封闭。随后与CD11b一抗4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤3次后，加入Alexa Flour^® 568标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗37 ℃孵育60 min。细胞核采用DAPI染色。染色完成后，于尼康ECLIPSE 80i显微镜下观察。

TUNEL免疫荧光染色：按照TUNEL检测试剂盒说明书进行操作。细胞核采用DAPI复染，染色完成后于尼康ECLIPSE 80i显微镜下观察。

1.4 细胞实验

1.4.1 原代肝细胞分离

采用IV型胶原酶消化法[28]分离6~8周龄雄性小鼠原代肝细胞。麻醉小鼠后开腹暴露腹腔，于下腔静脉置入留置针，使用37 ℃恒温肝灌流液进行肝脏灌注。待肝脏适度充盈后，剪断门静脉充分灌流冲洗血液。随后换用含IV型胶原酶的消化液继续灌注消化。消化完成后取出全肝，撕破肝被膜释放肝细胞，细胞悬液经70 μm滤网过滤后，4 ℃、离心（50×g）3 min收集肝细胞。

1.4.2 细胞培养与缺氧复氧实验

实验选用原代肝细胞，共设置5组。Ctrl组：先以0.1%DMSO预处理1 h，之后置于正常空气条件（5%CO₂）下培养；0-H/R组：先以0.1%DMSO预处理1 h，随后进行缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）处理；L-H/R组：术前1 h用10 μmol·L^-1 SOP预处理，之后进行H/R处理；M-H/R组：术前1 h用25 μmol·L^-1 SOP预处理，之后进行H/R处理；H-H/R组：术前1 h用50 μmol·L^-1 SOP预处理，之后进行H/R处理。

H/R处理具体操作：将细胞置于无糖无血清DMEM培养基中，在缺氧条件（94%N₂、1%O₂和5%CO₂）下培养6 h；之后更换为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的正常DMEM培养基，在正常空气条件（5%CO₂）下，于37 ℃复氧6 h。

AMPK抑制实验：设置3组。0-H/R组：先以0.1%DMSO预处理1 h，随后进行H/R处理； H-H/R组：术前1h用50 μmol·L^-1 SOP预处理，之后进行H/R处理；H+CC-H/R组：在50 μmol·L^-1SOP处理同时加入5 μmol·L^-1 AMPK抑制剂Compound C（CC）共孵育，随后进行H/R处理。

1.4.3 细胞活力检测

采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。按实验要求将细胞（8×10³个/孔）接种于96孔板，每组设5个复孔，同时设立3个不含细胞的空白对照孔。处理结束后，每孔加入CCK-8反应液，继续培养2~3 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值。

1.5 RT-qPCR检测

采用TRIzol试剂提取肝组织或细胞样本总RNA，按照Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录反应。使用SYBR Green PCR预混液进行定量PCR检测。反应程序设置为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s、60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCq法计算目的基因mRNA相对表达量。所用引物序列见表1。

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  表格1 qRT-PCR所用引物

  Table 1.Primers used for qRT-PCR

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1.6 Western blot分析

取肝组织或细胞样本，加入放射免疫沉淀法裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）提取总蛋白，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。取等质量蛋白样品上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳后转印至聚偏二氟乙烯膜。用含0.1% Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液缓冲液配制5%脱脂牛奶封闭液，室温封闭1 h。三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液洗涤3次（每次5 min）后，与一抗4 ℃孵育过夜。再次使用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液洗涤后，与相应二抗室温孵育1 h。最后使用化学发光显影系统检测信号。

1.7 RNA测序与数据分析

采用Trizol试剂从肝脏组织中提取总RNA，使用Nanodrop-1000分光光度计测定RNA浓度与纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。选取质量较高的样本（260 nm/280 nm吸光度比值 ＞1.9）进行RNA测序。根据测序平台操作指南构建测序文库，随后使用MGISEQ-2000 RS测序平台进行双端50 bp测序。

原始双端测序数据通过转录组拼接比对软件HISAT2（Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts 2）比对至小鼠参考基因组（mm10/GRCm38）。利用序列比对工具SAMtools将序列比对/映射格式（sequence alignment/map，SAM）文件转换为二进制比对/映射格式（binary alignment/map，BAM）文件。随后，使用StringTie软件默认参数计算各鉴定基因的每千碱基外显子模型每百万映射片段数（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）值。

在主成分分析（principal component analysis，PCA）中，采用R语言gmodels软件包中的fast.prcomp函数，并通过二维散点图可视化主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的数值。在基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）中，根据基因差异表达水平对基因进行排序，基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库的基因集被检测是否集中分布于排序列表的顶部或底部，以探究整体表达变化。采用Java GSEA软件，以“Signal2Noise”为指标进行GSEA分析，将P＜0.05且错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.25的基因集视为具有统计学显著性。在KEGG通路分析中，根据KEGG数据库的注释结果及官方分类，将差异表达基因归类至不同信号通路。使用R语言phyper函数对所有差异表达基因进行富集分析，将P＜0.05的通路定义为显著富集通路。热图采用R语言pheatmap包绘制。

1.8 分子对接分析

以AMPK晶体结构（PDB ID：4QFR）作为模板，使用Schrödinger软件的“蛋白质制备向导”（Protein Preparation Wizard，Schrödinger LLC，纽约，2021版）对蛋白质结构进行预处理，小分子化合物则通过Ligprep模块进行制备。结合区域通过一个以晶体结构中配体质心为中心、尺寸与配体相近的立方体框进行定义。对接与评分采用高精度（extra precision，XP）模式，其他参数均保留默认设置。最终基于Glide评分值及蛋白-配体相互作用分析，输出最优对接构象。

1.9 统计学分析

使用SPSS 29.0软件进行数据分析，所有数据均以表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOP抑制H/R诱导的肝细胞损伤、炎症反应及凋亡

为探究SOP是否对H/R诱导的肝细胞损伤具有调控作用，本研究采用不同浓度SOP预处理肝细胞后进行H/R刺激。如图1-A所示，SOP可显著抑制H/R刺激引起的细胞活力下降，且抑制作用随SOP浓度升高而增强。此外，SOP对炎症反应的抑制作用同样呈现浓度依赖性，表现为H/R诱导的Tnf、Il6、Il8及Ccl2上调幅度降低，同时抑制NF-κB信号通路的激活（图1-B至图1-F）。进一步分析发现，随着SOP浓度升高，H/R处理导致的促凋亡分子（Bad和Bax）表达上调及抗凋亡分子（Bcl2）表达下调均得到逆转（图1-G至图1-I）。综上，这些结果表明SOP可在体外有效抑制H/R诱导的肝细胞损伤、炎症反应及细胞凋亡。

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  图1 SOP抑制H/R诱导的肝细胞损伤、炎症反应及细胞凋亡

  Figure 1.SOP inhibits H/R-induced hepatocyte injury, the inflammatory response and apoptosis

  注：A. CCK-8法检测小鼠原代肝细胞活力；B~E. RT-qPCR检测小鼠原代肝细胞炎症相关基因mRNA表达水平；F. Western blot检测小鼠原代肝细胞NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平及其半定量分析；G和H. RT-qPCR检测小鼠原代肝细胞凋亡相关基因mRNA表达水平；I. Western blot检测小鼠原代肝细胞凋亡相关蛋白表达水平结果及其定量分析；与Ctrl比较，*P<0.05，**P<0.01；与0-H/R组比较，#P<0.05，##P<0.01。

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2.2 SOP减轻小鼠HIRI

为进一步探究SOP对体内HIRI的影响，选取雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，体重24~27 g）给予不同浓度的SOP预处理，随后实施肝脏I/R手术。结果显示，再灌注后，经SOP处理的小鼠血清ALT和AST水平显著低于未处理组小鼠（图2-A和图2-B）。此外，组织学分析表明，SOP处理组小鼠的肝脏坏死程度较未处理组更轻，坏死面积随SOP浓度升高呈比例性减小（图2-C）。综上，结果证实SOP可减轻小鼠肝I/R诱导的肝损伤。

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  图2 SOP减轻小鼠HIRI

  Figure 2.SOP alleviates HIRI in mice

  注：A和B. 小鼠血清ALT（A）和 AST（B）水平（n=10）；C.小鼠肝组织H&E染色图像（200×）；D.小鼠肝组织坏死水平定量分析（n=6）；与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01；与0-I/R组比较，#P<0.05，##P<0.01。

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2.3 SOP减轻肝脏I/R诱导的炎症反应

在HIRI过程中，炎症反应是导致肝细胞损伤的重要因素[29-30]。为探究SOP对HIRI期间炎症反应的影响，本研究通过CD11b免疫荧光染色分析肝组织中炎症细胞的浸润情况。结果显示，小鼠肝脏I/R造模后，SOP给药组肝组织中CD11b阳性浸润炎症细胞的数量显著低于未给药组（图3-A）。此外，SOP给药组小鼠肝脏中促炎基因（包括Tnf、Il1b、Il6、Ccl2和Ccl5）的表达水平较未给药组显著降低（图3-B至图3-F）。进一步检测发现，SOP给药组NF-κB信号通路的激活被抑制，表现为IKKβ和p65的磷酸化水平降低，同时总IkBα蛋白水平升高（图3-G）。表明SOP可抑制肝脏I/R诱导的炎症反应，且SOP浓度越高，抑制作用越强。

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  图3 SOP减轻肝脏I/R诱导的炎症反应

  Figure 3.SOP reduces hepatic I/R-induced inflammation

  注：A. 小鼠肝组织CD11b免疫荧光染色图像及其定量分析（200×），n=4；B~F. RT-qPCR检测小鼠肝组织炎症相关基因mRNA表达水平（n=4）；G. Western blot检测小鼠肝组织NF-κB信号通路相关蛋白表达水平及其半定量分析（n=3）；与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01；与0-I/R组比较，#P<0.05，##P<0.01。

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2.4 SOP减轻肝脏I/R诱导的细胞凋亡

为探究SOP对肝脏I/R过程中细胞死亡的影响，采用TUNEL染色法进行分析。结果显示，与未给药组小鼠相比，SOP给药组肝细胞凋亡显著受到抑制（图4-A）。进一步检测发现，SOP给药组小鼠肝组织中促凋亡分子Bad和Bax的mRNA及蛋白表达水平均较未给药组降低，而抗凋亡因子Bcl2的表达水平则显著升高（图4-B至图4-E）。上述结果提示SOP可减轻肝脏I/R诱导的肝细胞凋亡。

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  图4 SOP减轻肝脏I/R诱导的细胞凋亡

  Figure 4.SOP reduces hepatic I/R-induced apoptosis

  注：A. TUNEL法检测小鼠肝组织凋亡水平及定量分析（200×），n=4；B~D. RT-qPCR检测小鼠肝组织凋亡相关基因mRNA表达水平（n=4）；E. Western blot检测小鼠肝组织凋亡相关蛋白的表达水平及半定量分析（n=3）；与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01；与0-I/R组比较，#P<0.05，##P<0.01。

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2.5 SOP通过多靶点调控抑制肝HIRI中的炎症与凋亡反应

为系统解析SOP的调控网络，对SOP处理的肝脏I/R模型组和对照组肝组织进行RNA测序分析。PCA显示两组样本明显分离，表明存在显著差异（图5-A）。GSEA提示对照组中白细胞跨内皮迁移、TNF信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路及细胞凋亡等炎症与凋亡相关通路显著激活，而SOP处理可整体抑制上述通路（图5-B和图5-C）。热图分析显示，SOP给药后炎症与凋亡相关核心基因表达水平普遍下调（图5-D）。综上，本研究从转录组学层面证实SOP可抑制肝脏缺血再灌注损伤引发的炎症与凋亡反应。

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  图5 肝脏I/R模型中SOP给药的RNA测序分析结果

  Figure 5.RNA-Seq analysis results from mice livers administrated with or without SOP after I/R

  注：A. PCA结果（n=3）； B. 基于KEGG数据库的GSEA柱状图（n=3）；C. TNF信号通路、NF-κB信号通路及细胞凋亡的GSEA评分图；D. 显示炎症相关(左)和凋亡相关（右）核心基因表达差异。

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2.6 SOP通过激活AMPK抑制H/R诱导的肝细胞损伤、炎症及凋亡

KEGG通路分析显示，AMPK信号通路变化最为显著，提示SOP可能通过调控AMPK影响肝脏缺血再灌注损伤进程（图6-A）。本研究检测了SOP处理后H/R肝细胞及I/R肝组织中AMPK及其磷酸化蛋白水平。Western blot结果显示，与H/R或I/R组相比，SOP给药组AMPK磷酸化水平显著升高（图6-B和图6-C），表明SOP可促进HIRI中AMPK的激活。

为验证SOP对HIRI的保护作用是否依赖AMPK激活，分别及联合使用SOP和AMPK抑制剂（CC）处理肝细胞后进行H/R刺激。Western blot检测发现CC可完全阻断SOP对AMPK的激活作用（图6-D）。此外，SOP对H/R诱导的细胞损伤、炎症反应及凋亡的抑制作用也被CC逆转（图6-E至图6-G）。

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  图6 SOP通过激活AMPK抑制H/R诱导的肝细胞损伤、炎症及凋亡

  Figure 6.SOP inhibits H/R-induced hepatocyte injury, inflammation and apoptosis via activation of AMPK

  注：A. RNA-seq数据库的KEGG富集分析；B. Western blot检测小鼠原代肝细胞总AMPK及磷酸化AMPK蛋白表达水平及半定量分析；C. Western blot检测小鼠肝组织总AMPK及磷酸化AMPK蛋白表达水平及半定量分析（n=3）；D. 使用SOP与CC处理，Western blot检测小鼠原代肝细胞总AMPK及磷酸化AMPK蛋白表达水平及半定量分析；E. 使用SOP与CC处理，CCK-8法检测小鼠原代肝细胞活力；F. 使用SOP与CC处理，RT-qPCR检测小鼠原代肝细胞炎症相关基因mRNA表达水平；G. 使用SOP与CC处理，RT-qPCR检测小鼠原代肝细胞凋亡相关基因mRNA表达水平；（B和C）与Ctrl（或Sham）组比较，*P<0.05，**P<0.01；与0-H/R（或0-I/R）组比较，#P<0.05，##P<0.01；（D~G）与0-H/R组比较，*P<0.05，**P<0.01；与H-H/R组比较，#P<0.05，##P<0.01。

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进一步通过Schrödinger软件分子对接分析显示，SOP与AMPK（PDB ID：4QFR）之间存在稳定相互作用，其XP Gscore值为-6.549，低于已报道的AMPK激活剂Cl-A769662（XP Gscore=-8.487）[31]。根据PDB数据库，AMPK由三个亚基组成：链A（AMPK催化亚基α1）、链B（AMPK调节亚基β1）和链C（AMPK调节亚基γ1）。SOP与链A的Gly19、Lys31、Asp88以及链 B的Asp108、Asn111形成的氢键共同维持了这种稳定相互作用（图7）。上述结果表明AMPK介导了SOP对肝脏I/R损伤的保护作用。

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  图7 腺苷酸活化蛋白激酶（PDB ID：4QFR）与 SOP 的分子动力学模拟（上）和对接（下）

  Figure 7.The molecular dynamic stimulation (upper) and docking (down) of AMPK (PDB ID：4QFR) and SOP

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3 讨论

HIRI是肝切除及肝移植术中常见的病理过程，以缺血期的能量代谢障碍与再灌注期的氧化应激、炎症反应及细胞凋亡共同导致的肝功能损伤为主要特征[32-34]。再灌注后大量炎性细胞浸润，释放TNF-α、IL^-1β和IL-6等炎症介质，激活NF-κB等信号通路，进一步促进细胞凋亡，加重组织损伤[35-36]。因此，针对HIRI过程中炎症反应与细胞凋亡的调控已成为减轻肝损伤的重要策略[37-38]。

槐角作为传统中药，富含异黄酮、黄烷酮及三萜类等活性成分，具有抗炎、抗氧化及细胞保护作用[39]。其中的主要活性成分SOP已被报道可通过抑制COX-2活性[19]、阻断NF-κB信号通路[20]、缓解肥大细胞介导的过敏反应[17]等发挥抗炎效应。本研究系统评估了SOP在HIRI中的作用，结果显示SOP在体内外均能显著缓解缺血再灌注导致的肝细胞损伤。体外模型中，SOP减轻了小鼠原代肝细胞在H/R刺激下的活性下降，抑制炎性因子释放及细胞凋亡；小鼠体内模型结果显示，SOP可显著减轻肝组织坏死、炎性细胞浸润及转氨酶升高，表明其具有明确的肝保护作用。

值得注意的是，转录组学分析结果表明AMPK信号通路在SOP干预HIRI模型中显著富集。AMPK作为细胞能量稳态的关键调控因子，已被证实在维持肝脏代谢平衡及抗氧化应激中发挥重要保护作用[40-41]。本研究发现，SOP能显著促进AMPK的磷酸化，而AMPK特异性抑制剂CC可完全逆转SOP的保护作用，提示AMPK的激活是SOP缓解HIRI的关键环节。此外，分子对接结果显示SOP可与AMPK蛋白形成稳定结合，为其直接或间接激活AMPK提供了结构学依据。

综上所述，本研究首次系统揭示了SOP在缓解肝脏缺血再灌注损伤中的显著保护作用，并证实其核心机制依赖于AMPK信号通路的激活。具体而言，SOP通过激活AMPK有效信号通路抑制炎症反应与细胞凋亡，维持肝细胞能量稳态，进而减轻组织损伤。该研究为天然产物在HIRI防治中的应用提供了新的理论依据，也为基于“SOP-AMPK”信号轴的药物开发提供了潜在方向。然而，本研究仍具有一定局限性，SOP促进AMPK活化的上游调控机制及其与NF-κB、MAPK等信号通路的交互仍需进一步研究，以全面阐明其作用网络。

本研究表明，SOP能够显著缓解肝脏炎症反应、抑制细胞凋亡，并有效预防肝脏I/R所致的肝损伤。其肝脏保护作用主要通过激活AMPK信号通路实现，该发现为靶向调控AMPK通路以减轻肝脏缺血再灌注损伤的后续研究提供了重要理论依据。

利益冲突声明：作者声明本研究不存在任何经济或非经济利益冲突。

1.Konishi T, Lentsch AB. Hepatic ischemia/reperfusion: mechanisms of tissue injury, repair, and regeneration[J]. Gene Expr, 2017, 17(4): 277-287. DOI: 10.3727/105221617X15042750874156.

2.Izuishi K, Tsung A, Hossain MA, et al. Ischemic preconditioning of the murine liver protects through the Akt kinase pathway[J]. Hepatology, 2006, 44(3): 573-580. DOI: 10.1002/hep.21298.

3.Kuboki S, Shin T, Huber N, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice[J]. Hepatology, 2008, 47(1): 215-224. DOI: 10.1002/hep.21963.

4.Zhang R, Zhang L, Manaenko A, et al. Helium preconditioning protects mouse liver against ischemia and reperfusion injury through the PI3K/Akt pathway[J]. J Hepatol, 2014, 61(5): 1048-1055. DOI: 10.1016/j.jhep.2014.06.020.

5.Zhang XJ, Cheng X, Yan ZZ, et al. An ALOX12-12-HETE-GPR31 signaling axis is a key mediator of hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Nat Med, 2018, 24(1): 73-83. DOI: 10.1038/nm.4451.

6.Abu-Amara M, Yang SY, Tapuria N, et al. Liver ischemia/reperfusion injury: processes in inflammatory networks--a review[J]. Liver Transpl, 2010, 16(9): 1016-1032. DOI: 10.1002/lt.22117.

7.Shen X, Reng F, Gao F, et al. Alloimmune activation enhances innate tissue inflammation/injury in a mouse model of liver ischemia/reperfusion injury[J]. Am J Transplant, 2010, 10(8): 1729-1737. DOI: 10.1111/j.1600-6143.2010.03205.x.

8.Barone S, Okaya T, Rudich S, et al. Distinct and sequential upregulation of genes regulating cell growth and cell cycle progression during hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2005, 289(4): C826-C835. DOI: 10.1152/ajpcell.00629.2004.

9.Jaeschke H, Woolbright BL. Current strategies to minimize hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting reactive oxygen species[J]. Transplant Rev (Orlando), 2012, 26(2): 103-114. DOI: 10.1016/j.trre.2011.10.006.

10.Cai J, Chen X, Liu X, et al. AMPK: the key to ischemia-reperfusion injury[J]. J Cell Physiol, 2022, 237(11): 4079-4096. DOI: 10.1002/jcp.30875.

11.Li J, Li J, Fang H, et al. Isolongifolene alleviates liver ischemia/reperfusion injury by regulating AMPK-PGC1α signaling pathway-mediated inflammation, apoptosis, and oxidative stress[J]. Int Immunopharmacol, 2022, 113(Pt A): 109185. DOI: 10.1016/j.intimp.2022.109185.

12.Kola B. Role of AMP-activated protein kinase in the control of appetite[J]. J Neuroendocrinol, 2008, 20(7): 942-951. DOI: 10.1111/j.1365-2826.2008.01745.x.

13.Bejaoui M, Zaouali MA, Folch-Puy E, et al. Bortezomib enhances fatty liver preservation in Institut George Lopez-1 solution through adenosine monophosphate activated protein kinase and Akt/mTOR pathways[J]. J Pharm Pharmacol, 2014, 66(1): 62-72. DOI: 10.1111/jphp.12154.

14.Chen K, Li G, Geng F, et al. Berberine reduces ischemia/reperfusion-induced myocardial apoptosis via activating AMPK and PI3K-Akt signaling in diabetic rats[J]. Apoptosis, 2014, 19(6): 946-957. DOI: 10.1007/s10495-014-0977-0.

15.Kataoka Y, Shibata R, Ohashi K, et al. Omentin prevents myocardial ischemic injury through AMP-activated protein kinase-and Akt-dependent mechanisms[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(24): 2722-2733. DOI: 10.1016/j.jacc.2014.03.032.

16.Zheng L, Ling W, Zhu D, et al. Roquin-1 regulates macrophage immune response and participates in hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. J Immunol, 2020, 204(5): 1322-1333. DOI: 10.4049/jimmunol.1900053.

17.杨尚明, 雷杰, 陈鹏, 等. 药物治疗在肝切除术中预防缺血再灌注损伤的研究进展[J]. 数理医药学杂志, 2024, 37(6): 446-452. [Yang SM, Lei J, Chen P, et al. Progress of pharmacotherapy in the prevention of ischemia-reperfusion injury during hepatectomy[J]. Journal of Mathematical Medicine, 2024, 37(6): 446-452.] DOI: 10.12173/j.issn.1004-4337.202401019.

18.Kim SJ, Lee GY, Jung JW, et al. The ameliorative effect of sophoricoside on mast cell-mediated allergic inflammation in vivo and in vitro[J]. Molecules, 2013, 18(5): 6113-6127. DOI: 10.3390/molecules18056113.

19.Kim BH, Lee S. Sophoricoside from Styphnolobium japonicum improves experimental atopic dermatitis in mice[J]. Phytomedicine, 2021, 82: 153463. DOI: 10.1016/j.phymed.2021.153463.

20.Kim BH, Chung EY, Ryu JC, et al. Anti-inflammatory mode of isoflavone glycoside sophoricoside by inhibition of interleukin-6 and cyclooxygenase-2 in inflammatory response[J]. Arch Pharm Res, 2003, 26(4): 306-311. DOI: 10.1007/BF02976960.

21.Wu YX, Zeng S, Wan BB, et al. Sophoricoside attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by activating the AMPK/Nrf2 signaling axis[J]. Int Immunopharmacol, 2021, 90: 107187. DOI: 10.1016/j.intimp.2020.107187.

22.Aaron SL, DeBlois KW. Acute necrotizing ulcerative gingivitis[M]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2023.

23.Chen Y, Lei Y, Wang H, et al. Sophoricoside attenuates autoimmune-mediated liver injury through the regulation of oxidative stress and the NF-κB signaling pathway[J]. Int J Mol Med, 2023, 52(3): 78. DOI: 10.3892/ijmm.2023.5281.

24.Li W, Lu Y. Hepatoprotective effects of sophoricoside against fructose-induced liver injury via regulating lipid metabolism, oxidation, and inflammation in mice[J]. J Food Sci, 2018, 83(2): 552-558. DOI: 10.1111/1750-3841.14047.

25.Kim BH, Lee S. Sophoricoside from Styphnolobium japonicum improves experimental atopic dermatitis in mice[J]. Phytomedicine, 2021, 82: 153463. DOI: 10.1016/j.phymed.2021.153463.

26.Wu Y, He S, Zhang Y, et al. Sophoricoside ameliorates methicillin-resistant Staphylococcus aureus-induced acute lung injury by inhibiting Bach1/Akt pathway[J]. Phytomedicine, 2024, 132: 155846. DOI: 10.1016/j.phymed.2024.155846.

27.Tsung A, Sahai R, Tanaka H, et al. The nuclear factor HMGB1 mediates hepatic injury after murine liver ischemia-reperfusion[J]. J Exp Med, 2005, 201(7): 1135-1143. DOI: 10.1084/jem.20042614.

28.Tao Q, Tianyu W, Jiangqiao Z, et al. Tripartite motif 8 deficiency relieves hepatic ischaemia/reperfusion injury via TAK1-dependent signalling pathways[J]. Int J Biol Sci, 2019, 15(8): 1618-1629. DOI: 10.7150/ijbs.33323.

29.Gurusamy KS, Kumar Y, Ramamoorthy R, et al. Vascular occlusion for elective liver resections[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2009(1): CD007530. DOI: 10.1002/14651858.CD007530.

30.Hammond JS, Guha IN, Beckingham IJ, et al. Prediction, prevention and management of postresection liver failure[J]. Br J Surg, 2011, 98(9): 1188-1200. DOI: 10.1002/bjs.7630.

31.Calabrese MF, Rajamohan F, Harris MS, et al. Structural basis for AMPK activation: natural and synthetic ligands regulate kinase activity from opposite poles by different molecular mechanisms[J]. Structure, 2014, 22(8): 1161-1172. DOI: 10.1016/j.str.2014. 06.009.

32.He X, Bai Y, Zhao Z, et al. Local and traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of Sophora japonica L.: a review[J]. J Ethnopharmacol, 2016, 187: 160-182. DOI: 10.1016/j.jep.2016.04.014.

33.Wang PX, Zhang R, Huang L, et al. Interferon regulatory factor 9 is a key mediator of hepatic ischemia/reperfusion injury[J]. J Hepatol, 2015, 62(1): 111-120. DOI: 10.1016/j.jhep.2014.08.022.

34.Zhou J, Guo L, Ma T, et al. N-acetylgalactosaminyltransferase-4 protects against hepatic ischemia/reperfusion injury by blocking apoptosis signal-regulating kinase 1 N-terminal dimerization[J]. Hepatology, 2022, 75(6): 1446-1460. DOI: 10.1002/hep.32202.

35.Dickson I. Improving hepatic ischaemia-reperfusion injury outcomes[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 16(10): 583. DOI: 10.1038/s41575-019-0194-y.

36.Wang S, Li S, Liu Q, et al. The OsSPL16-GW7 regulatory module determines grain shape and simultaneously improves rice yield and grain quality[J]. Nat Genet, 2015, 47(8): 949-954. DOI: 10.1038/ng.3352.

37.Sun P, Zhang P, Wang PX, et al. Mindin deficiency protects the liver against ischemia/reperfusion injury[J]. J Hepatol, 2015, 63(5): 1198-1211. DOI: 10.1016/j.jhep.2015.06.033.

38.Wang X, Mao W, Fang C, et al. Dusp14 protects against hepatic ischaemia-reperfusion injury via Tak1 suppression[J]. J Hepatol, 2017: S0168-8278(17)32275-4. DOI: 10.1016/j.jhep.2017.08.032.

39.Zhou J, Hu M, He M, et al. TNFAIP3 interacting protein 3 is an activator of hippo-YAP signaling protecting against hepatic ischemia/reperfusion injury[J]. Hepatology, 2021, 74(4): 2133-2153. DOI: 10.1002/hep.32015.

40.Kadono K, Kageyama S, Nakamura K, et al. Myeloid ikaros-SIRT1 signaling axis regulates hepatic inflammation and pyroptosis in ischemia-stressed mouse and human liver[J]. J Hepatol, 2022, 76(4): 896-909. DOI: 10.1016/j.jhep.2021.11.026.

41.Pu JL, Huang ZT, Luo YH, et al. Fisetin mitigates hepatic ischemia-reperfusion injury by regulating GSK3β/AMPK/NLRP3 inflammasome pathway[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2021, 20(4): 352-360. DOI: 10.1016/j.hbpd.2021.04.013.