欢迎访问中南医学期刊社系列期刊网站！
欢迎访问中南医学期刊社系列期刊网站！
近年来，各国药典陆续修订核磁共振波谱法通则，以适应核磁共振波谱技术的发展，并扩大其在生药、化学药品、生物制品、药用辅料和药包材等通则和品种标准中的应用。本文介绍了各国药典核磁共振波谱法通则概况及在品种标准中的应用现状，旨在为中国药典0441核磁共振波谱法通则的修订和核磁共振波谱法在我国制药领域中的进一步应用提供参考。
核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）法是一种基于特定原子核在外磁场中吸收了与其裂分能级间能量差相对应的射频场能量而产生共振现象的分析方法。NMR法作为一种通用的检测技术，在从液体核磁共振到固体核磁共振（solid-state nuclear magnetic resonance，SSNMR）、从一维核磁共振（one dimensional nuclear magnetic resonance，1D NMR）到二维核磁共振（two dimensional nuclear magnetic resonance，2D NMR）、从氢核磁共振（1H-nuclear magnetic resonance，1H NMR）到杂原子NMR应用等诸多方面都具有显著优势，在药品质量控制如组分鉴定、杂质鉴定、药物含量分析中应用广泛，已用于多种药品的质量标准中[1-3]。1975年，美国药典（United States Pharmacopoeia，USP）第19版、英国药典（British Pharmacopoeia，BP）1975年增补版收载了NMR方法，日本药局方（Japanese Pharmacopoeia，JP）第12版和欧洲药典（European Pharmacopoeia，EP）4.0版也分别于1991年和2002年收载了该法，中国药典2010年版也收载了该法[4]。近年来，随着NMR技术的发展和对药品质量控制的更高要求，USP、EP和JP对NMR法通则进行了修订，并扩大了其在生药、化学药品、生物制品、药用辅料和药包材等通则和品种标准中的应用。本文介绍了USP现行版、EP 10.8版、JP 第18版中NMR法通则的收载情况，旨在为中国药典相关标准的制定和NMR法在药品质量控制中的进一步应用提供参考。
1 各国药典NMR法通则
1.1 USP现行版<761>NMR法、<1761> NRM法的理论和应用
美国食品药品管理局（FDA）批准的大多数NMR方法是基于USP <761>NMR法通则和<1761>NMR法的理论与应用指导原则开发的。2022年，在系统性地参考了USP <1058>分析仪器确证、<1010>分析数据的解释与处理、<1039>化学计量学、<1210>方法验证的统计学工具、<1220>分析方法的生命周期、<1225>分析方法验证、<1226>分析方法确认等指导原则的基础上，USP修订了<761>NMR法通则、<1761>NMR法的理论与实践指导原则，两个章节互为补充[5]。
1.1.1 <761>NMR法
<761>包括简介、NMR仪的确证、定性和定量分析、验证和确认四部分。其中，NMR仪的确证、验证和确认是USP独有的内容[1]。
在核磁共振波普仪的确证部分中指出，NMR仪器和分析方法作为一个集成系统发挥作用，产生波谱数据或其他测定结果，并且必须符合预期目的。由于分析方法的有效性依赖于仪器控制关键过程参数，仪器必须通过设计、确证和持续确认进行验证。NMR仪的确证是根据预先批准的协议，作为质量管理体系的一部分进行记录的过程，通常在设计确证（design qualification，DQ）、安装确证（installation qualification，IQ）、操作确证（operational qualification，OQ）和性能确证（performance qualification，PQ）不同的阶段进行。
对于NMR的验证和确认，<761>提出可采用生命周期方法（首选）或传统方法。定量核磁（quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR）的生命周期方法与<1220>分析方法生命周期指导原则中阐述的一致，考虑了分析方法整个生命周期中发生的验证活动。方法的生命周期包括分析目标概况（analytical target profile，ATP），以及方法设计、分析方法性能确证（analytical procedure performance qualification，APPQ）、持续方法性能验证（continued procedure performance verification，CPPV）三个阶段。对于定量和半定量应用，应指定ATP报告值可接受的最大测量不确定度。第一阶段方法设计中，要进行分析方法的开发、质量风险管理（quality risk management，QRM）、建立方法可操作设计区间（method operable design region，MODR）。第二阶段APPQ中，要记录APPQ规程、评估测量不确定度、记录APPQ结果形成文档，并最终确定分析控制策略（analytical control strategy，ACS）和复制策略。第三阶段CPPV中，要进行分析方法性能的常规监控和变更后方法性能的评估，以确定分析方法是否持续符合预期目的。此外，也可使用<1225>和ICH Q2（R1）分析方法验证指导原则中收载的传统方法验证程序和<761>中给出的NMR方法最低验证标准。但对于一些特定应用，应根据预期用途采用更严格的标准以证明适用性。
1.1.2 <1761>NMR法的理论和应用
<1761>对<761>中的内容进行了补充，提供了NMR在药典和制药工业中的实践和应用，包括简介、原理、定义、NMR的特性、NMR仪、仪器准备、采集参数、其他实验考虑、采集后数据处理、溶液核磁共振应用、2D NMR和台式核磁共振12个部分内容[1]。<1761>的内容概要见图1。
<1761>指出，NMR是化学定量分析中最有用和最通用的技术之一。定量核磁共振（quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR）可通过直接与标准物质比较确定溶液中特定物质的含量，也可确定样品中两种或多种物质的相对量，如药用盐中活性药物成分与其有机抗衡离子之间的摩尔比，确定嵌段共聚物的平均链长，或计算每种单体的重均相对分子质量。1D 1H qNMR是最常用的NMR定量方法。根据分析物性质，19F、13C、31P和35Cl等定量方法也具有优势。2D NMR的定量测定可采取2D NMR信号校准策略和使用本质上定量的特定2D NMR实验策略，如时间零HSQC（time-zero HSQC0）、定量异核单量子相干（quantitative heteronuclear single quantum coherence，Q-HSQC）和定量完善和纯移位HSQC (quantitative perfected and pure shifted HSQC，QUIPU-HSQC)。qNMR方法的准确性取决于各种采集和处理参数，如脉冲角、采集时间、弛豫延迟、光谱宽度、自由感性衰减信号（free induction decay，FID）中的点数、扫描次数、数据处理期间用于零填充的点数、窗口函数、基线校正、积分范围和温度。响应重叠问题可以通过使用先进的处理技术（如反卷积方法）或依靠2D qNMR解决。也可使用待测分析物固有的NMR特性，如化学位移和耦合常数来开发量子力学模型，量子力学模型可以在不同磁场的NMR仪器之间操作，这使台式仪器能够利用高场NMR仪器获得的信息。
<1761>介绍了用于弛豫测量的永磁体紧凑型NMR仪。台式NMR由于其有限的灵敏度和光谱分散性，不适合阐明复杂和未知的分子结构，但可用于鉴别试验，如原材料的质量控制和检测掺假药物等。台式NMR的定量应用最适用于具有ATP的方法，该方法对测量不确定度具有适当的容忍度，用于测定浓缩和相对简单的物质。大多数台式NMR波谱仪都与流量兼容，在反应和过程的实时或在线监测方面显示出了巨大的潜力，可用作监测动力学的工具，也可用于优化产率、成本、时间的反应参数。
1.2 EP 10.8版2.2.33 NMR法
EP 10.8版2.2.33包括简介、原理、仪器、傅里叶变换核磁共振（fourier transform NMR，FT-NMR）、参数、为定量目的优化采集和处理参数、溶液中样品的NMR、定性分析、定量分析、测定方法和SSNMR法共11个部分内容[6]。与各国药典不同，2.2.33介绍了SSNMR法。SSNMR法使用特定装置的NMR仪分析固态样品。一些技术可以为单个原子位点提供可观察的单个谱线，将NMR法的适用性扩展到无机材料。2.2.33介绍了魔角旋转（magic angle spinning，MAS）、高功率去耦和交叉极化（cross polarisation，CP）三种技术。这些技术的结合可提供固体玻璃、无定型物以及陶瓷、聚合物或矿物学来源的结晶材料的化学结构细节的大量信息。
1.3 JP 第18版2.21 NMR法
JP第18版2.21包括简介、仪器、方法、仪器和测定条件的记录和鉴别五部分[7]。2.21利用了一定篇幅介绍了用于各种目的的1H和13C NMR的1D、2D和多维技术。自旋去耦和奥弗豪塞尔核效应（nuclear overhauser effect，NOE）可用于1D 1H NMR，宽带去耦、非灵敏核的极化转移增强（insensitive nuclei enhancement by polarization transfer，INEPT）和无畸变极化转移增强（distortionless enhancement by polarization transfer，DEPT）常应用于1D 13C NMR。对于2D NMR，例举了一些同核和异核测定技术，如相关谱（correlation spectroscopy，COSY）、全相关谱（total correlation spectroscopy，TOCSY）、同核哈特曼-哈恩谱（homonuclear Hartmann-Hahn spectroscopy，HOHAHA）、核欧佛豪瑟效应频谱（nuclear overhauser effect spectroscopy，NOESY）、双量子谱（incredible natural abundance double quantum transfer experiment，INADEQUATE）、异核多量子相干谱（heteronuclear multiple quantum coherence，HMQC）、远程碳氢相关（heteronuclear multiple bond coherence，HMBC）、2D J分解谱（2D J-resolved spectroscopy）、双量子滤波COSY（double quantum filtered-COSY，DQF-COSY）、近程碳氢相关（heteronuclear single quantum coherence，HSQC）和扩散排序谱（diffusion-ordered spectroscopy，DOSY）。同时指出，多维核磁共振技术可用于分析大分子物质。
1.4 中国药典2020年版0441 NMR法
中国药典2020年版0441通则包括原理、NMR仪、核磁共振谱、测定方法四部分[8]。定性分析可采用双共振实验、化学交换、使用位移试剂、各种二维谱等特定技术，简化复杂图谱、确定特征基团以及确定耦合关系等。定量分析中提供了绝对定量模式和相对定量模式的供试品溶液制备方法、测定方法和计算公式，并简要例举了需要注意的实验参数的设置及优化项目。
USP现行版、EP 10.8版、JP第18版和中国药典2020年版的NMR法通则内容对比见表1。
2 NMR法在各国药典中的应用
2.1 NMR法在各国药典通则中的应用
2.1.1 NMR法在USP现行版通则中的应用
在USP现行版有关合成药物、疫苗、生物技术产品、药用辅料和药包材、通用检测方法等通则中，提及了NMR法在鉴别、表征、含量测定、杂质检查和特性检查中的应用，见表2[1]。
此外，USP现行版收载了<198>疫苗中使用的细菌多糖的NMR鉴别试验通则，介绍了NMR在疫苗生产中使用的细菌多糖鉴别试验中的应用。<198>提供了两个方法，第一种方法利用一个1D 1H NMR，产生样品所有所需信息，与标准品波谱比较共振位置、线宽、相对强度和谱峰多重性。也可通过计算相关系数评估在相同条件下和相同基质中获取的待测样品和标准品的波谱轮廓相似性。第二种方法将多糖脱乙酰化后简化多糖的波谱，采集第二个1D 1H NMR波谱，定量O-乙酰化的程度。两种方法的选择应基于待测样品的性质和所需的信息[1]。
2.1.2 NMR法在EP 10.8版通则中的应用
在EP 10.8版2.2.64 NMR法鉴别肽通则中，采用1D 1H NMR法进行短肽产物（最多约15个氨基酸）的定性鉴别。方法采集的波谱宽度须包含肽的完整波谱，一般为12 ppm或16 ppm。优化温度、pH值、缓冲液和肽浓度等参数以提高特征峰的分辨率，收集的数据点数量要能够充分定义峰值。给出了所需的关键波谱参数，如使用30°短脉冲宽度和快速重复频率，最小信噪比为50 ∶ 1，以及特征共振峰的鉴别要求[6]。在EP 10.8版5.16结晶性通则中指出，SSNMR法可提供晶型多态性和分子构象的信息[6]。
2.1.3 NMR法在JP 第18版通则中的应用
JP 第18版5.01生药试验通则介绍了采用NMR法测定汉方制剂的生药和提取物的标志物，包括NMR法定量分析原理、qNMR法标准物质和软件、汉方制剂的生药和提取物定量分析用标志物和标准物质，以及操作qNMR的注意事项。5.01指出，测定结果保留两位有效数字就足以保证定量分析的准确性。为达到杂质与峰分离所需的分辨率和灵敏度，需要使用400 MHz以上的磁场[7]。
2.2 NMR法在各国药典品种标准中的应用
2.2.1 NMR法在USP现行版品种标准中的应用
USP现行版中共有17个品种标准，包括9个化药和8个辅料采用NMR进行质量控制。其中，4个化药和8个辅料品种采用1H qNMR法进行含量测定和特定检测，2个化药品种采用13C谱进行定性鉴别，见表3。
2.2.2 NMR法在EP 10.8版品种标准中的应用
EP 10.8版中共有25个品种标准，包括14个化药、6个生物制品和5个辅料采用NMR法进行质量控制。其中，3个化药和5个辅料品种采用qNMR法进行含量测定和检查，其中3个采用13C qNMR法检查脂肪酸中β（2）-酰基的位次分布、脂肪醇的平均链长和环氧乙烷的平均含量。1个化药品种采用19F进行杂质的定性检查，见表4。
2.2.3 NMR法在JP 第18版品种标准中的应用
JP第18版中共有55个化药品种标准采用1H NMR法进行定性鉴别和纯度检查，但没有定量分析，见表5。此外，JP 第18版利用qNMR法测定生药检验中使用的化学试剂的绝对纯度。
2.2.4 NMR法在中国药典2020年版品种标准中的应用
中国药典2020年版中共有5个辅料品种标准采用NMR法进行质量控制，利用qNMR法进行氧乙烯含量和丙交酯乙交酯摩尔比的检查，见表6。但中药、化药和生物制品品种标准中还没有应用NMR法。
3 对中国药典0441 NMR法通则的修订展望
可以看出，中国药典2020年版0441 NMR法通则内容较USP现行版、EP 10.8版和JP第18版简单，缺少1H及杂核（13C、19F及31P等）谱定性和qNMR方法优化的参数（如谱宽、脉冲序列、采样时间、弛豫延迟时间、采样次数、增益等）要求、2D NMR、SSNMR、NMR的方法验证、台式NMR仪等相关内容，在品种标准中的应用与各国药典相比也有较大差距。随着NMR技术日益成熟，以及在药品质量控制中的应用日益广泛，增修订中国药典0441 NMR法通则的上述内容，将提高方法的先进性和对实际应用的指导性，促进NMR法在中国药典中的应用。
3.1 qNMR法
中国药典2020年版一般采用高效液相色谱法或紫外可见分光光度法等对药物进行定量分析，但缺乏对照品时，色谱法和光谱法难以准确定量。近年来随着仪器的发展、数据处理系统的升级和实验方法的改进，NMR法逐渐成为主流的定量分析方法，可克服上述含量测定方法的缺陷[2, 9-11]。因此，扩大qNMR法在中国药典中的应用将更好地满足药品质量控制的要求。USP现行版、EP 10.8版中利用1H qNMR法测定结构较明确的高聚物辅料中的甲氧基、乙氧基、羟丙氧基含量，较中国药典通则0712甲氧基、乙氧基和羟丙氧基含量测定法中的气相色谱法和容量法操作更为简便。文献也报道了利用1H qNMR法同时测定茶苯海明中苯海拉明和8-氯茶碱的绝对含量和相对含量，弥补了各国药典所采用的滴定法繁琐且专属性不强的缺点[12]。除了1H qNMR法外，其他杂核的定量核磁技术也逐渐成熟。EP 10.8版中的养殖鱼肝油、养殖三文鱼油标准中已采用13C qNMR法检查脂肪酸中β（2）-酰基的位次分布，辅料品种月桂醇400标准中采用13C qNMR法检查脂肪醇的平均链长和环氧乙烷的平均含量。19F qNMR法在含氟化学药品的含量测定中也具有潜在的应用前景[9]。
3.2 2D NMR法
较1D NMR法而言，2D NMR法可以提供更为丰富的化合物结构信息，解决物质结构空间构象问题，与传统的分析化学方法相结合，是化合物结构解析的强大分析手段[9]。2D qNMR法是一种间接定量方法，采用1D和2D qNMR法相结合，在准确定量方面具有优势。近年来，随着技术的发展，缩短了2D qNMR法的分析时间又提高了分析性能[13-16]，尽管USP现行版、EP 10.8版和JP第18版中没有品种标准应用2D NMR，但都在NMR法通则中介绍了各种2D NMR技术。文献也报道了利用Q-HSQC测定肝素和低分子量肝素定量组成并进行方法验证等[17]。因此中国药典0441 NMR法通则可借鉴各国药典，增加2D NMR法中常用的COSY、HSQC等技术的介绍，促进其在药品质量控制中的应用。
3.3 NMR法的方法验证
随着ICH Q2（R2）分析方法验证指导原则、Q14分析方法建立指导原则的增修订，参考USP现行版<761>，在中国药典0441 NMR法通则中引入基于生命周期方法的分析方法验证要求，增强对方法的理解和对变异来源的控制，使方法评价水平与风险级别相适应，通过持续监控促进方法的持续改进和变更控制，为分析方法的验证、转移和确认增加灵活性，使方法更加稳健耐用，将为NMR法在中国药典中的应用打下坚实的基础。
3.4 SSNMR法
随着MAS、CP等技术的进步，SSNMR法的分辨率得到明显改善，所需样品采集时间逐渐缩短，其在药物多晶型与药物共晶研究中的应用日趋成熟和广泛[2, 18-19]。EP 10.8版2.2.33 NMR法通则中收载了SSNMR技术，并在5.16结晶性通则中列为药物多晶型研究的分析方法。中国药典2020年版9015药品晶型研究及晶型质量控制指导原则中也将SSNMR列为多晶型与共晶物质定性分析的技术方法，但在0441 NMR法通则中尚未收载该内容。因此，补充完善SSNMR法相关内容，将提高中国药典0441 NMR法通则的全面性和先进性。
3.5 台式NMR
高场NMR仪器的高价格和高维护成本、对分析人员的高要求以及潜在的安全问题是其应用的障碍。近年来，可安装在实验室工作台的小尺寸低场（90MHz）台式NMR仪器的性能逐步提高，已应用于反应监测及简单化合物的质量控制。因此，参考USP现行版<1761>，研究其在品种中的应用实践，将加速其在过程分析技术、质量控制和药典中的应用[9-20]。
4 小结
NMR法是药物分析领域广泛应用的一种技术方法，是药品研发和质量控制的有力手段之一。近年来，随着NMR技术的发展和对药品质量控制的更高要求，USP、EP和JP均对NMR法通则进行了修订，并扩大了其在生药、化学药品、生物制品、药用辅料和药包材等通则和品种标准中的应用。目前中国药典NMR法通则在内容的全面性、先进性以及对实际应用的指导性方面，与国际发达国家或地区的药典仍存在差距，如在仪器及测定方法的关键参数、定量核磁、二维核磁、固体核磁、方法验证、台式NMR等方面存在完善提高的空间。因此，参考借鉴各国药典的收载内容，跟踪国际前沿技术趋势，修订中国药典NMR法通则，发挥NMR法可同时进行定性定量分析且不需要特殊对照品等的特点及优势，扩大NMR的应用范围，将更好地满足我国药品研发、生产、质量控制和监管的需求。
1.USP(44th eds)[S]. 2022: 13-15, 18-19, 110, 114-115, 118, 125.
2.Wang ZF, You YL, Li FF, et al. Research progress of NMR in natural product quantification[J]. Molecules, 2021, 26(20): 6308. DOI: 10.3390/molecules26206308.
3.张琪, 李晓东, 杨化新. 核磁共振技术在药品标准领域中的应用进展[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(3): 545-549. [Zhang Q, Li XD, Yang HX. Application of nuclear magnetic resonance in pharmaceutical standards[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2012, 32(3): 545-549.] DOI: 10.16155/j.0254-1793.2012.03.040.
4.国家药典委员会. 中国药典分析检测技术指南[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2017: 127.
5.Giancaspro G, Adams KM, Bhavaraju S, et al. The qNMR summit 5.0: proceedings and status of qNMR technology[J]. Anal Chem, 2021, 93(36): 12162-12169. DOI: 10.1021/acs.analchem.1c02056.
6.EP(10.8th eds)[S]. 2022: 5860, 118119, 797796.
7.JP(18th eds)[S]. 2021: 4850, 147151.
8.中国药典2020年版. 四部 [S]. 2020: 5355.
9.张庆生, 何兰, 刘阳, 等, 主编. 氟核磁共振技术在药品质量控制中的应用[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2022: 1-6.
10.Holzgrabe U, Malet-Martino M. NMR spectroscopy in pharmaceutical and biomedical analysis[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 93: 1-2. DOI: 10.1016/j.jpba.2014.04.007.
11.Coulibaly FS, Alnafisah AS, Oyler NA, et al. Direct and real-time quantification of bortezomib release from alginate microparticles using boron (11B) nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Mol Pharm, 2019, 16(3): 967-977. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00873.
12.张才煜, 耿颖, 卢日刚, 等. 核磁共振定量法测定茶苯海明的含量[J]. 中国药事, 2018, 32(6): 743-746. [Zhang CY, Geng Y, Lu RG, et al. Quantitative determination of the content of dimenhydrinate by qNMR[J]. Chi-nese Pharmaceutical Affairs, 2018, 32(6): 743-746.] DOI: 10.16153/j.1002-7777.2018.06.008.
13.Fardus-Reid F, Warren J, LeGresley A. Validating heteronuclear 2D quantitative NMR[J]. Anal Methods, 2016, 8(9): 2013-2019. DOI: 10.1039/c6ay00111d.
14.Le PM, Milande C, Martineau E, et al. Quantification of natural products in herbal supplements: a combined NMR approach applied on goldenseal[J]. J Pharm Biomed Anal, 2019, 165: 155-161. DOI: 10.1016/j.jpba.2018.11.062.
15.Sette M, Wechselberger R, Crestini C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR[J]. Chem-istry, 2011, 17(34): 9529-9535. DOI: 10.1002/chem.201003045.
16.Girreser U, Ugolini T, Çiçek SS. Quality control of Aloe vera (Aloe barbadensis) and Aloe ferox using band-selective quantitative heteronuclear single quantum correlation spectroscopy (bs-qHSQC)[J]. Talanta, 2019, 205: 120109. DOI: 10.1016/j.talanta.2019.07.004.
17.Heikkinen S, Toikka MM, Karhunen PT, et al. Quantitative 2D HSQC（Q-HSQC）via suppression of J-dependence of polarization transfer in NMR spectroscopy：application to wood lignin[J]. J Am Chem Soc, 2003, 125(14): 4362-4367. DOI: 10.1021/ja029035k.
18.Bryce DL, Bernard GM, Gee M, et al. Practical aspects of modern routine solid-state multinuclear magnetic resonance spectroscopy: one-dimensional experiments[J]. Can J Anal Sci Spectrosc, 2001, 46(2): 46-81. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=1w460cj00b5k0mv0re1c0gn0nq282918&site=xueshu_se&hitarticle=1.
19.Li M, Xu W, Su Y. Solid-state NMR spectroscopy in pharmaceutical sciences[J]. TrAC Trends Anal Chem，2021, 135: 116152. DOI: 10.1016/j.trac.2020.116152.
20.崔莉, 姜娇娇, 王涛, 等. 低场核磁技术结合化学计量学法快速检测掺假阿胶产品[J]. 时珍国医国药, 2019, 30(7): 1628-1633. [Cui L, Jiang JJ, Wang T, et al. Rapid detection of adulterated Ejiao by low-field nuclear magnetic resonance combined with chemometrics[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research , 2019, 30(7): 1628-1633.] DOI: 10.3969/j.issn.1008-0805.2019.07.029.