目的  探讨前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）在前列腺癌（PCa）中的生物学功能及其对铁死亡敏感性的影响，以期为PCa的治疗提供新的思路。

方法  利用生物信息学分析PCSK9与PCa预后的关系，并利用RT-qPCR检测PCa细胞系中PCSK9的表达情况。利用siRNA构建干扰PCSK9的PCa细胞，通过CCK-8实验和Transwell实验分析PCSK9在体外对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。利用癌症治疗反应门户（CTRP）分析PCSK9与铁死亡药物敏感性的相关性，并通过铁死亡诱导剂（RSL3）处理PCa细胞，检测细胞敲低PCSK9后对铁死亡诱导剂敏感性的变化。

结果  生物信息学分析显示，PCSK9低表达患者具有较长的癌症特异性生存期（P＜0.05）。体外实验结果表明，敲低PCSK9的表达能显著抑制PCa细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P＜0.001）。此外，CTRP分析显示细胞对铁死亡诱导剂的敏感性与PCSK9的表达水平相关；PCSK9敲低细胞对铁死亡诱导剂RSL3展现出更高的敏感性。

结论  敲低PCSK9抑制PCa细胞的增殖、迁移和侵袭，并增加细胞对铁死亡诱导剂的敏感性，有望为PCa的治疗提供新的思路。

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全球男性中第二常见的癌症类型[1]。我国PCa的发病率逐年升高，其中超过半数的患者初诊时已经发生转移[2]。雄激素剥夺疗法（androgen deprive therapy，ADT）是主要的治疗方法，但ADT治疗18~24个月后，大部分患者会从激素敏感性PCa进展为转移性去势抵抗性PCa（metastatic castration resistant prostate cancer，mCRPC）[3]。mCRPC的恶性程度高，肿瘤异质性大，容易产生治疗抵抗导致治疗失败[4]。因此，亟需探索新的治疗策略以改善PCa患者的预后。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）是前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员，因其在胆固醇代谢调节中的关键作用及其对心血管疾病的影响而受到广泛关注[5-6]。PCSK9不仅调节脂质代谢，还涉及炎症反应、病毒感染、肿瘤进展及免疫检查点调节等多个生物学过程[7-8]。在肿瘤进展中，PCSK9可以促进食管癌、肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤细胞的增殖和迁移[9-11]；敲低PCSK9可以促进肺腺癌和胃癌细胞的凋亡[12-13]；下调PCSK9表达能抑制头颈部鳞状细胞癌的肿瘤干性[14]。PCSK9正逐渐成为多种恶性肿瘤的生物标志物，并有望成为新的治疗靶点。

铁死亡作为一种新型程序性细胞死亡方式，其特征为铁依赖性和脂质过氧化积累[15]。PCSK9通过降解低密度和极低密度脂蛋白受体，抑制载脂蛋白B降解等方式调节细胞的脂质代谢[16]。由于铁死亡与脂质过氧化密切相关，PCSK9对脂质代谢的调控可能对铁死亡的敏感性产生影响。在肝癌中，抑制PCSK9可以促进肿瘤细胞发生铁死亡[17]。然而，目前尚不清楚PCSK9是否与PCa细胞铁死亡相关。

诱导细胞发生铁死亡被认为是应对肿瘤治疗抵抗的新策略[18]。诱导铁死亡不仅能直接抑制肿瘤细胞的生长，还能增强免疫治疗效果[19]。许多恶性肿瘤如多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、及胆管癌等均被认为是对铁死亡敏感的肿瘤类型[20-21]。肿瘤中多种基因和信号通路在调控细胞生物学功能的同时，对细胞铁死亡也具有重要的调控作用。如Yes相关蛋白/PDZ结合基序转录共激活因子信号通路不仅调控肿瘤细胞增殖和分化，还可通过细胞密度改变肿瘤细胞对铁死亡的敏感性[22]。Kruppel样因子2通过上调谷胱甘肽过氧化物酶4增强细胞的抗氧化能力，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的同时，降低细胞对铁死亡的敏感性[23]。基于此，本研究探讨PCSK9对PCa细胞功能的影响及其与铁死亡药物敏感性之间的关联性，以期为PCa的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Sorvall Micro 17/17R微量离心机（美国Thermo Fisher Scientific）、NanoDrop One超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific）、1300生物安全柜（美国Thermo Fisher Scientific）、细胞培养孵箱（美国Thermo Fisher Scientific）、L2-6K台式低速离心机（中国湖南可成仪器设备有限公司）、IC1000细胞计数仪（中国Countstar）、S1000 Thermal Cycler PCR仪（美国Bio-Rad）、CFX Connect PCR仪（美国Bio-Rad）、倒置荧光显微镜（日本Olympus）、Alliance Q9化学发光凝胶成像仪（英国Uvitec）。

RPMI 1640细胞培养液（批号：61240203）、F-12K Nutrient Mixture (1X) 培养基（批号：2956325）、DMEM高糖培养基（批号：6124110）均购自美国Gibco；0.25%胰酶（批号：2995340）购自美国Gibico；胎牛血清（批号：2428321）购自中国达特希尔生物科技；青霉素-链霉素-两性霉素B溶液（批号：A069241015）购自中国碧云天。Eastep总RNA提取试剂盒（批号：0000604674）购自上海Promega；逆转录试剂盒（批号：AN70490A）购自日本TaKaRa；PCR引物序列由上海生工合成；(1S, 3R)-RSL3（批号：HY-100218A）购自美国MCE；CCK8试剂盒（批号：PH600）购自日本Dojindo；Transwell小室（批号：1322010）购自美国Corning；结晶紫染色液（批号：111621220401）购自中国碧云天；siRNA购自苏州吉玛基因；Lipofectamine 2000（批号：2856134）购自美国Thermo Fisher Scientific；Opti-MEM（批号：2962140）购自美国Gibco；PCSK9抗体（批号：ab181142）购自英国Abcam；RIPA裂解液（批号：A034240830）、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（批号：123022230511）购自中国碧云天；5×SDS上样缓冲液（批号：21050195）购自中国Biosharp；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔lgG（批号：CR2212109）购自武汉塞维尔；10×TBST缓冲液（批号：241705001）购自中国Solarbio；PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%，批号：038C11500）购自中国雅酶；PVDF膜（批号：0000342136）购自美国Bio-Rad；特超敏ECL化学发光试剂盒（批号：103122230516）购自中国碧云天。

1.2 细胞

前列腺癌细胞系（22RV1、C4-2、PC3、DU145）来源于中国科学院细胞库或武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染

22RV1、C4-2细胞在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的1640培养液中培养，PC3细胞在含有10% FBS的F-12K培养液中培养，DU145细胞在含有10% FBS的DMEM培养液中培养。所有细胞在37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养2~3代，取对数生长期的细胞进行后续实验。

设置阴性对照组（si-NC）及实验组siRNA-PCSK9（siRNA-605、948、1536及2239），6孔板中每孔接种2×10⁵个细胞。铺板24 h后，在无血清的培养基中使用Lipofectamine 2000进行转染，转染48 h后采用RT-qPCR法检测mRNA表达，并在转染72 h后进行Western Blot检测干扰效率。siRNA-605: GGGAUACCUCACCAAGAUCTT;siRNA-948:CAGCAAGUGUGACAGUCAUTT;siRNA-1536:CCACUUCUCUGCCAAAGAUTT;siRNA-2239:GACAACACGUGUGUAGUCATT;NC:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。

1.3.2 细胞总RNA提取及实时荧光定量PCR

根据Eastep总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，采用分光光度仪对获得的RNA进行定量及纯度鉴定。参照PrimeScript RT试剂盒的说明书，取1 μg RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行qPCR扩增。PCR反应液包括12.5  μL的Genious 2X SYBR Green Fast qPCR、1 μL的PCR上游引物（10 μmol·L^-1）、1 μL的PCR下游引物（10 μmol·L^-1）、1 μL的cDNA溶液和9.5 μL的去离子水，总体积为25 μL。将上述反应液置于PCR仪中进行反应，反应条件如下：①95 ℃预变性30 s；②PCR反应（循环40次）：95 ℃反应5 s、60 ℃反应30 s。PCSK9上游引物序列为5'-GACACCAGCATACAGAGTGACC-3'，下游引物序列为5'-GTGCCATGACTGTCACACTTGC-3'；内参基因GAPDH上游引物序列为5'-CCATGG AGAAGGCTGGGG-3',下游引物序列为5'-CAAA GTTGTCATGGATGACC-3'。采用2^{（-ΔΔCt）}法计算各目的基因mRNA相对表达量。

1.3.3 蛋白免疫印迹

将RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按照50 ∶ 1 ∶ 1的比例制备蛋白裂解液，混匀后冰上裂解细胞30 min，4 ℃条件下13 000×g离心30 min后取上清，并与适量5×SDS上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸10 min；配置10% SDS-PAGE分离胶，泳道中加入蛋白样，80 V电泳30 min，150 V电泳60 min；235 mA转膜100 min将蛋白转至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h。一抗（GAPDH抗体1 ∶ 1 000稀释、PCSK9抗体1 ∶ 5 000稀释）4 ℃过夜孵育；次日用三羟甲基氨基甲烷缓冲液（tris-borate-sodium tween-20，TBST）室温洗膜3次，每次10 min；室温孵育二抗（1 ∶ 10 000稀释）1 h；TBST室温洗膜3次，每次10 min；借助ECL发光液使蛋白条带在化学发光凝胶成像仪中显影；Image J软件对所得图片进行灰度分析。

1.3.4 细胞增殖实验

实验分为si-NC、si-948及si-1536组。细胞转染24 h后种于96孔板中，按照CCK-8试剂说明书进行浓度配比（配比1 ∶ 10），避光加入后反应2 h，并每间隔24 h加入配比试剂，测定各时间点450 nm处的吸光度（absorbance，A）值，并记录数据。每组设立3个复孔。

1.3.5 细胞迁移实验

实验分为si-NC、si-948及si-1536组。提前在24孔板下层加入500 μL含有血清的培养基。细胞消化离心后使用无血清培养基重悬，以每100 μL 3万个的细胞密度加入Transwell小室上层，孵育18 h。取出Transwell小室，棉签擦净小室上层细胞，甲醇固定15 min后风干，结晶紫染色15 min。用显微镜观察，每个小室取5个视野进行拍照分析。每组设立3个复孔。

1.3.6 细胞侵袭实验

实验分组同上，基质胶铺在Transwell小室上层，小室下层加入500 μL含有血清的培养基。细胞消化离心后使用无血清培养基重悬，以每100 μL 4万个的细胞密度加入Transwell小室上层，孵育24 h。后续步骤同迁移实验。每组设立3个复孔。

1.3.7 生物信息学分析

在仙桃学术平台（https://www.xiantaozi.com/products/apply）上获取498例TCGA数据库中PCa患者的mRNA表达水平及临床信息，并利用仙桃学术平台进行PCSK9与PCa患者预后的生存曲线分析。

根据基因集癌症分析平台（GSCA，http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/）综合分析PCSK9与多种药物耐药性之间的关系；根据癌症治疗反应门户（CTRP，https://portals.broadinstitute.org/ctrp/）分析PCSK9对铁死亡诱导剂（ML162、ML210和RSL3）的耐药性的相关性。

1.3.8 耐药实验

将转染后的细胞铺至96孔板，每孔3×10³个细胞；24 h后用铁死亡诱导剂RSL3（0、0.25、0.5、1、2、4 μmol·L^-1）处理细胞。72 h后，加入CCK-8试剂37 ℃孵育120 min检测光密度（optical density，OD）值，并计算细胞相对存活率（%）。每组设立3个复孔。

1.4 统计学分析

采用GraphPad prism 8.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以表示，2组间比较采用两独立样本配对t检验，多组比较采用单因素方差分析。基因表达与铁死亡药物抵抗性之间的相关性采用Pearson相关分析。检验水准为α=0.05，所有检验均采用双侧检验。

2 结果

2.1 PCSK9高表达患者比低表达患者具有更差的预后

在仙桃学术平台中，根据PCSK9 mRNA表达水平的中位数，将PCa患者分为高表达组和低表达组。结果显示，低表达组患者的总生存期优于高表达组患者，但差异没有统计学意义（P = 0.100，图1-A）。由于PCa进展缓慢，患者可能死于其他原因而非PCa本身，同时后续治疗效果也可能影响总生存期，因此进一步分析疾病特异生存期这一结局指标。低表达组患者的疾病特异生存期显著优于高表达组患者（P ＜0.05）（图1-B）。提示PCSK9可作为PCa预后的生物标志物。

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  图1 PCSK9 mRNA的表达量与PCa总生存期和疾病特异生存期的关系

  Figure 1.The relationship between PCSK9 mRNA expression and overall survival and disease specific survival in prostate cancer patients

  注：A. 为总生存期；B. 为疾病特异生存期。

  

2.2 PCSK9在PCa细胞中的表达及敲低细胞株的构建

为探究PCSK9的体外生物学功能，首先使用RT-qPCR在4个PCa细胞系中测量其表达水平。在22RV1、C4-2、PC3、DU145四种细胞系中，PC3和DU145细胞的PCSK9 mRNA表达量较高，故选择这两种细胞进行敲低PCSK9的细胞功能实验（图2-A）。

与对照组相比，转染的4个siRNA在PC3和DU145细胞中表达量均降低，差异有统计学意义（P＜0.000 1），见图2-B、图2-C和表1，表明敲低成功。此外，进行Western Blot分析PCSK9敲低后蛋白水平的变化，结果发现两种细胞转染si-948和si-1536后PCSK9蛋白水平均降低较多（图2-D）。基于上述结果，选择4组中PCSK9 mRNA表达量和蛋白水平敲低效果较明显的si-948和si-1536组进行后续生物学功能实验。

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  图2 PCSK9在前列腺癌细胞中的表达及其敲低效果验证

  Figure 2.PCSK9 expression in prostate cancer cells and the effect of its knockdown

  注：A. 为4种PCa细胞系中PCSK9的mRNA表达水平；B、C. 为敲除PCSK9后PC3和DU145细胞中PCSK9 mRNA表达量；D. 为Western blot检测PC3和DU145细胞中PCSK9蛋白水平；与si-NC组比较，****P＜0.000 1。

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  表格1 PPC3和DU145细胞转染siRNA后PCSK9 mRNA相对表达水平（ x ± s，n=3）

  Table 1.Relative expression levels of PCSK9 mRNA in PC3 and DU145 transfected with siRNA ( x ± s, n=3)

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2.3 敲低PCSK9后抑制PCa细胞增殖

在转染siRNA后进行CCK-8实验，检测PCa细胞增殖情况。CCK-8结果显示，在5 d时间内，si-948和si-1536组的A450显著低于si-NC组（P＜0.001），表明敲低PCSK9抑制DU145和PC3细胞的增殖活性（图3、表2）。

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  图3 敲低PCSK9对前列腺癌细胞增殖能力的影响

  Figure 3.Effect of PCSK9 knockdown on proliferation of prostate cancer cells

  注：A. 为CCK-8法检测DU145细胞si-NC组、si-948和si-1536组细胞增殖能力；B. 为CCK-8法检测PC3细胞si-NC组、si-948和si-1536组细胞增殖能力；与si-NC组比较，ns表示P＞0.05，*P＜0.05，**P<0.01，***P<0.001。

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  表格2 敲低PCSK9后各组细胞增殖结果（ x ± s，n=3）

  Table 2.Statistics of cell proliferation results in each group after knockdown of PCSK9 ( x ± s, n=3)

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2.4 敲低PCSK9后抑制PCa细胞迁移和侵袭

进一步探索敲低PCSK9对PCa细胞迁移和侵袭的影响。Transwell迁移结果显示，与si-NC组相比，si-948和si-1536组中DU145（P＜0.001）和PC3（P＜0.001）细胞迁移水平显著降低（图4-A、图4-B、图4-C和表3）。Transwell侵袭实验显示，与si-NC组相比，si-948和si-1536组DU145（P ＜0.001）和PC3（P＜0.000 1）细胞侵袭水平显著降低（图4-D、图4-E、图4-F和表3）。以上结果表明敲低PCSK9可以抑制PCa细胞迁移和侵袭。

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  图4 敲低PCSK9对前列腺癌细胞迁移和侵袭的影响

  Figure 4.Effect of PCSK9 knockdown on migration and invasion of prostate cancer cells

  注：A. 为敲低PCSK9后DU145和PC3细胞迁移能力（20×）；B. 为DU145细胞迁移统计直方图；C. 为PC3细胞迁移统计直方图；D. 为敲低PCSK9后DU145和PC3细胞侵袭能力（20×）；E. 为DU145细胞侵袭统计直方图；F. 为PC3细胞侵袭统计直方图；与si-NC组比较，***P<0.001，****P<0.000 1。

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  表格3 敲低PCSK9前列腺癌细胞迁移和侵袭的结果 （ x ± s, n=3）

  Table 3.Statistics of the migration and invasion results of PCSK9 knockdown prostate cancer cells ( x ± s, n=3)

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2.5 细胞对铁死亡诱导剂的敏感性与PCSK9相关

通过GSCA数据库综合分析了PCSK9与多种药物抵抗性的相关性。结果发现肿瘤细胞中，PCSK9与多种铁死亡诱导剂（RSL3、ML162和ML210）耐药性正相关（图5-A）。

进一步通过CTRP具体分析PCSK9与3种铁死亡诱导剂之间的相关性，通过Pearson相关系数进一步说明，在多种肿瘤中PCSK9的表达与对铁死亡药物抵抗性呈正相关（图5-B）。

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  图5 PCSK9与铁死亡的相关性

  Figure 5.The relationship between PCSK9 and ferroptosis

  注：A. 为在GSCA中，PCSK9与多种药物抵抗性的相关性；B. 为在CTRP中，PCSK9的表达与对铁死亡诱导剂ML210、ML162和RSL3抵抗性的相关性；Pearson相关系数表示两者之间的相关程度，正相关表明较高的基因表达可能导致耐药，负相关表明较高的基因表达可能导致药物更敏感；GEX（gene expression）表示基因表达量；AUC（area under curve）为每个化合物与肿瘤细胞系间浓度-反应曲线下面积。

  

2.6 敲低PCSK9后PCa细胞对RSL3敏感性增加

利用不同浓度铁死亡诱导剂RSL3（0、0.25、0.5、1、2、4 μmol·L^-1）处理转染后的DU145和PC3细胞，结果PCSK9敲低细胞表现出对铁死亡诱导剂RSL3更高的敏感性（图6和表4），提示敲低PCSK9更容易诱发PCa细胞发生铁死亡。

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  图6 敲低PCSK9后PCa细胞对RSL3的敏感性变化

  Figure 6.Changes in sensitivity of prostate cancer cells to RSL3 after knockdown of PCSK9

  注：A. 为CCK-8法检测DU145细胞si-NC组、si-948和si-1536组对RSL3的敏感性；B. 为CCK-8法检测PC3细胞si-NC组、si-948和si-1536组对RSL3的敏感性。

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  表格4 敲低PCSK9后DU145和PC3细胞对RSL3的敏感性变化结果（ x ± s，n=3）

  Table 4.Statistical results of changes in sensitivity of DU145 and PC3 to RSL3 after PCSK9 knockdown ( x ± s, n=3)

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3 讨论

本研究通过生物信息学分析发现PCSK9与PCa患者预后密切相关，提示PCSK9可能参与PCa的发生发展。细胞生物学功能研究发现，干扰PCSK9表达后，PCa细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到显著抑制。同时，干扰PCSK9也可增加PCa细胞对铁死亡诱导剂RSL3的敏感性。本研究结果不仅证实了敲低PCSK9对PCa细胞恶性生物学行为的抑制作用，而且初步揭示了PCSK9在PCa中与铁死亡的相关性，为靶向PCSK9的临床治疗提供了新的思路。

PCSK9作为一种关键的胆固醇代谢调节因子，不仅在治疗血脂异常方面作用显著，也是肿瘤治疗的新希望[24]。多项研究[25]表明PCSK9与肿瘤生物学有关。在肝癌中，PCSK9通过脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）/B淋巴细胞瘤-2-Associated X的蛋白质（Bcl2-associated X，Bax）/B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/胱天蛋白酶（caspase）9/caspase 3通路抑制肿瘤细胞凋亡[26]；在胃癌中，PCSK9通过上调热休克蛋白70（heatshockprotein70，HSP70）来促进丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号传导通路，促进细胞侵袭[13]；PCSK9也可以通过调节上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号传导促进结肠癌细胞进展和转移 [27]；PCSK9还可以通过内质网应激和线粒体信号通路调节肺腺癌A549细胞凋亡[12]。本研究中，PCSK9表达的降低可明显抑制PCa细胞的增殖、迁移和侵袭能力，与其他类型癌症的研究结果一致。除以上机制外，这也可能与PCSK9促进低密度脂蛋白受体降解，调节细胞内胆固醇水平和影响细胞膜流动性中的作用有关[28]。胆固醇水平的改变可以操纵脂筏并影响肿瘤的发展[29]。在PCa中，胆固醇水平的升高会激活Hedgehog通路和白细胞介素6（interleukin 6，IL6）-信号传导-转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路等致癌途径促进PCa细胞转移[30-31]。综上，PCSK9可能通过脂质代谢和非脂质代谢两种途径促进肿瘤的发生发展。

细胞对铁死亡的敏感性高度依赖于细胞的代谢状态[32]。抑制PCSK9可通过提高脂质的摄取，使细胞膜中对脂质过氧化反应敏感的多不饱和脂肪酸含量增加。游离的多不饱和脂肪酸在被氧化前可酯化成膜磷脂，诱导铁死亡信号的发生[17]。多不饱和脂肪酸的过氧化也会使细胞容易受到铁死亡的影响[33]。本研究发现，敲低PCSK9的PCa细胞对铁死亡诱导剂RSL3的敏感性显著增加，说明抑制PCSK9可以增加细胞对铁死亡的敏感性。

综上所述，本研究证实了PCSK9在PCa细胞生物学行为中的作用，并揭示了其在调节细胞铁死亡中的潜在作用。未来的研究需要进一步探索敲低PCSK9对PCa细胞铁死亡影响的具体调控机制，为PCa的靶向治疗提供新的思路。

利益冲突声明：作者声明本研究不存在任何经济或非经济利益冲突。

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