目的  采用超高效液相串联-四极杆静电场轨道阱质谱（UPLC-Q/Orbitrap/MS/MS）技术，建立了一种高效的检测方法，对白虎加人参汤的化学成分进行了分析鉴定。

方法  采用Waters UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，在0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液中以0.4 mL·min^-1的速度进行梯度洗脱，正负离子模式同时进行检测；根据一级高分辨质谱准确的质荷比数据、二级高分辨质谱碎片离子、色谱保留时间，结合文献报道，对检出的化合物成分进行鉴定。

结果  检测到74个化合物成分，包含黄酮类、生物碱类、查耳酮类、山酮类、酚类、苯丙素类、萜类、三萜类、环烯醚萜类、氨基酸类、芳香族化合物等。

结论  利用UPLC–Q/Orbitrap/MS/MS技术对中药复方鉴定，为其物效机制、药理作用及其质量控制的进一步研究提供了初步的理论依据。

白虎加人参汤处方由人参（9 g）、知母（18 g）、甘草（6 g）、石膏（45 g）和粳米（12 g）组成，功能清热泻火、益气生津；主治伤寒或温病、里热盛而气阴不足、发热、烦渴、口舌干燥、汗多、脉大无力，以及暑病津气两伤、汗出恶寒、身热而渴等症[1]。近年来，白虎加人参汤被广泛用于糖尿病的治疗[2]。

中药方剂服用前需要煎煮，这会极大改变中药方剂的化学成分与比例[3]。为了明确中药方剂煎煮后的效应物质基础，需要一种技术手段对中药汤剂进行化学组分分析。白虎加人参汤作为传统中药方剂，目前尚无其汤剂的化学组分研究，这对其基础物质研究和临床应用存在着极大问题。超高效液相串联-四极杆静电场轨道阱质谱具有高灵敏度、碎片离子化程度高、选择性强、重现性好等优点。目前被广泛应用于代谢物测定、中药组分分析鉴定研究。本文基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱（UPLC-Q/Orbitrap/MS/MS）技术，对白虎加人参汤的中药煎剂进行了化学成分鉴定，确定了其中74种成分。本研究以期为该组方的物效机制、药效基础以及临床开发应用提供理论依据。

1 仪器与试药

安捷伦1290四元超高压液相色谱系统（美国安捷伦公司），Thermo Fisher Scientific Q Exactive Focus超高分辨质谱仪（美国Thermo Scientific公司），Heraeus Fresco17型高速离心机（美国Thermo Scientific公司），BSA124S-CW型电子天平(德国Sartorius公司)，YM-080S型超声仪（深圳市方奥微电子有限公司）。

人参、知母、甘草、石膏等药材购自西京医院药学部中药房（批号分别为201201、20210701、20210524、2107001），粳米由空军军医大学天然药物化学教研室提供，所有中药材经陕西中医药大学药学院宋小妹教授鉴定，均符合中国药典相关标准。甲醇、乙腈（质谱级，德国CNW公司），甲酸（色谱级，美国Sigma公司），超纯水由纯水机（德国Merck Millipore公司）制备。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

取人参9 g、知母18 g、甘草6 g、石膏45 g和粳米12 g，加入纯水750 mL，浸泡30 min，100 ℃下回流1 h，提取3次，合并滤液并过滤。利用旋转蒸发仪除去多余水分，浓缩至2 g·mL^-1。

取1 mL浓缩提取液涡旋30 s后，4 ℃、13 800×g离心15 min；取上清300 μL于EP管中，加入1 000 μL提取液（甲醇 ∶ 水=4 ∶ 1）；涡旋30 s后冰水浴超声5 min，4℃、13 800×g离心15 min；取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤；取5 μL进样。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters UPLC BEH C₁₈（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；柱温：35 ℃；进样体积；5 μL；流动相：0.1%甲酸水溶液∶ 0.1%甲酸乙腈溶液，在Agilent超高效液相1290 UPLC控制下按表1程序进行分析；流速：0.4 mL·min^-1。

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  表格1 白虎加人参汤全成分分析色谱梯度洗脱程序

  Table 1.Chromatographic gradient elution procedure for full component analysis of Bai-hu-jia-Renshen decoction

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2.3 质谱条件

质谱仪能够在控制软件（Xcalibur，Thermo Fisher Scientific）控制下基于FullScan-ddMS2功能进行一级、二级质谱数据采集。详细参数：鞘气速率 45 Arb；辅助气流速率 15 Arb；毛细管温度 400℃；Full ms 分辨率 70 000 FWHM；MS2分辨率 17 500 FWHM；循环次数 3；m/z扫描范围：100~1 500 Da；碰撞能量：NCE模式下15%，30%，45%；喷雾电压：4.0 kV(+)或-3.6 kV(-)。

2.4 结果

对白虎加人参汤复方水煎液中进行正负离子检测模式同时扫描，通过一级质谱的质荷比，二级质谱的裂解碎片，对比文献，初步鉴定化合物74个，11类。结果见图1和表2。

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  图1 白虎加人参汤基峰正离子模式（A）和负离子模式（B）的离子流图

  Figure 1.Total ion chromatogram of Baihu-jia-Renshen decoctionin positive (A) and negative (B) mode

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  表格2 白虎加人参汤UPLC-Q/Orbitrap/MS/MS鉴定成分

  Table 2.Identification components of Baihu-jia-Renshen decoctionin by UPLC-Q/Orbitrap/MS/MS

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2.4.1 生物碱类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了2个生物碱类化合物，为化合物3烟酸和化合物65三七素。以化合物3烟酸为例分析，保留时间t_R=0.87 min，实测值[M+H]⁺（m/z）=124.039，二级碎片有m/z 78.034，80.049，96.044。烟酸结构较为简单，质谱规律清晰，大多碎片为失去一分子水减去18的碎片，或脱掉羰基减少28的碎片。m/z 96.044为母离子脱去羰基的碎片，继续失去一分子水得到m/z 78.034。结合文献[4]和Thermo Scientific数据库检索分析可知，推断该化合物为烟酸。

2.4.2 氨基酸类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了5个氨基酸类化合物，分别为异亮氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸。5种氨基酸均在正离子模式下发现，保留时间分别为0.75，0.75，1.03，2.34，26.14 min。二级碎片中均有[M+H-COOH]⁺或[M+H-NH3]⁺[5]。

2.4.3 酚类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了1个酚类化合物，为化合物32没食子酸。t_R=2.77 min，实测值[M-H]^-（m/z）=169.041，二级碎片为151.004和125.024。负离子模式下，母离子脱掉一分子水得到碎片151.004。母离子脱掉-COO·后得到碎片125.024[6]。

2.4.4 苯丙素类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了4个苯丙素类化合物，分别为肉桂酸、隐绿原酸、邻香豆酸、刺五加苷E。以隐绿原酸为例分析，t_R=3.16 min，实测值[M-H]^-（m/z）=353.088，二级碎片为191.054，179.035，173.045，135.046，93.036。结合文献[7-8]报道，碎片191.054为C₇H₁₁O₆·，继续脱掉一分子水后得到碎片173.035。碎片179.035为C₉H₇O₄·，继续脱掉-COO·后得到碎片m/z 135.046，侧链与羟基进一步脱去后得到的碎片为C₆H₅O^-，m/z为93.036。

2.4.5 查尔酮类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了3个查尔酮类类化合物，分别为甘草查尔酮B、异甘草素、异甘草苷。以异甘草素为例分析，t_R=7.64 min，实测值[M+H]⁺（m/z）=257.081，二级碎片为239.069，211.076，147.045，137.023，119.049，92.65。母离子脱去一分子水得到碎片239.069。结合文献[9-10]可知137.023，119.049，92.65  3个碎片为异甘草素常见质谱二级碎片，分别为C₇H₅O₃⁺，C₈H₇O·，C₆H₄O·故确定该结构为异甘草素。

2.4.6 芳香族化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了1个芳香族化合物，为化合物31苯乙酸。t_R=2.63 min，实测值[M-H]^-（m/z）=135.045，二级碎片为107.049，91.054。母离子脱掉羰基得到碎片107.049，继续脱掉O^-离子得到碎片91.054。

2.4.7 环烯醚萜类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了1个环烯醚萜类化合物，为化合物37龙胆苦苷。t_R=4.65 min，实测值[M-H]^-（m/z）=355.104，二级碎片为177.055，149.019，119.009。龙胆苦苷醚键断裂后得到碎片C₁₀H₉O₃·，m/z为177.055，该碎片支链脱去后得到碎片C₈H₅O₃·，m/z为149.019，继续裂解得到碎片C₇H₃O₂₂·，m/z为119.009。结合文献[11]可知，该化合物为龙胆苦苷。

2.4.8 萜类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了27个萜类化合物，分别为拟人参皂苷F₁₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rg₃、人参皂苷Rg₅、人参皂苷Re、甘草皂苷G₂₀、人参皂苷Rf、竹节人参皂苷ⅣA、知母皂苷元、知母皂苷A-Ⅲ、人参皂苷Rk₁、20(S)-人参皂苷CK、土荆皮乙酸、洋地黄皂苷、知母皂苷BⅡ、苍术苷A、人参皂苷F₃、人参皂苷Rh₁、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rg₂、人参皂苷RO、人参皂苷Rb₂、人参皂苷F₁、木皂苷A、人参皂苷Rg₃、地肤子皂苷。以人参皂苷 Rg₁为例，t_R=8.4 min，实测值[M+Na]⁺（m/z）=823.482，二级碎片为643.594，497.363。人参皂苷Rg1母离子[M+Na]⁺脱掉Na⁺和断掉醚键失去一分子六碳糖后得到碎片C₃₆H₆₁O₉·，m/z为643.594。人参皂苷Rg₁母离子[M+Na]⁺两个醚键断裂失去两分子六碳糖后得到碎片C₃₀H₅₀O₄Na·，m/z为497.363。结合文献[12]可知，该化合物为人参皂苷Rg₁。

2.4.9 三萜类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了1个三萜类化合物，为化合物54蒺藜皂苷K。t_R=7.68 min，实测值[M-H]^-（m/z）=1 077.513，二级碎片为915.456，753.409。蒺藜皂苷母离子断掉醚键失去一分子六碳糖后得到碎片C₄₅H₇₁O₁₉·，m/z为915.456。蒺藜皂苷母离子断掉两个醚键失去两分子六碳糖后得到碎片C₃₉H₆₀O₁₄₂·, m/z为753.409[13]。

2.4.10 山酮类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了3个山酮类化合物，分别为新芒果苷、芒果苷、异芒果苷。与文献对比，在正离子模式下新芒果苷有二级碎片567.122，405.088。芒果苷与异芒果苷为同分异构体，与文献[14-16]对比，在正离子模式下存在387.069，339.049，303.05，273.041等主要二级碎片。因此可断定，化合物6、7、8分别为新芒果苷、芒果苷、异芒果苷。

2.4.11 黄酮类化合物

本试验从白虎加人参汤中鉴定了26个黄酮类化合物，分别为甘草苷、甘草素、山奈素、光甘草酮、甘草黄酮A、甘草查尔酮A、豆苷、异荭草素、棉花皮苷、荭草苷、牡荆素、金丝桃苷、射干苷、黄豆黄苷、异牧荆素、蒙花苷、橙皮素、(S )-柚皮素、山奈酚、异脱水淫羊霍素、去水淫羊藿黄素、新补骨脂异黄酮、黄腐酚、马卡因、光甘草定、桑黄酮。以山奈酚为例，t_R=8.10 min，实测值[M-H]^-（m/z）=285.040，二级碎片为185.063，151.004，109.029。山奈酚除了基准离子峰外，其余二级碎片离子峰的丰度较低，根据文献[7, 17]报道，185.063是其特征性的碎片离子。

3 讨论

中药组方绝对不是各味药材化学成分的简单叠加，在共同煎煮过程中，其成分可能会产生复杂的化学变化与比例改变。白虎加人参汤作为传统经典名方，目前尚无其煎煮液的组分鉴定研究，这极大的限制了该组方在临床上的应用与进一步开发。试验完全模拟临床上该组方的组成比例与给药剂型，利用水煎法进行提取，水煎液经过处理后进行化学成分分析。本试验利用UPLC-Q Exactive Focus高分辨率液质联用系统，首次对白虎加人参汤煎煮液进行了组分测定。通过对色谱峰精确分子质量、二级碎片离子信息，色谱保留时间，以及结合文献分析对比，确证了74个化合物，包括2个生物碱类化合物，5个氨基酸类化合物，1个酚类化合物，4个苯丙素类化合物，3个查尔酮类类化合物，1个芳香族化合物，1个环烯醚萜类化合物，27个萜类化合物，1个三萜类化合物，3个山酮类化合物，26个黄酮类化合物。本课题组在获得以上结果的基础上，通过与芒果苷、知母皂苷A-III、甘草苷、人参皂苷Rb₁、山奈酚、没食子酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁等标准品的保留时间与碎片离子对比，数据全部吻合，进一步确证了试验的准确性。本研究对该方剂的再次开发提供了药效物质基础与质量控制信息，确保了该方剂应用中的稳定性、安全性、有效性。

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