目的  建立快速测定头孢克肟颗粒溶出度的HPLC法，评价自研制剂和参比制剂的体外溶出曲线的相似性。

方法  采用HPLC法，色谱柱：Thermo Accucore C₁₈柱（50 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流动相：0.8%三氟乙酸水溶液-乙腈（80 ∶ 20）；流速：1.2 mL·min^-1；检测波长：254 nm；柱温：45℃；进样量：5 μL。分别测定头孢克肟颗粒自研制剂和参比制剂在4种溶出介质（水、pH 1.2盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.5磷酸盐缓冲液）中的溶出曲线。

结果  方法学验证结果均符合检测要求。头孢克肟在10.05~251.30 μg·mL^-1范围内线性关系良好，在4种介质中的平均回收率分别为99.3%，99.1%，100.2%和99.8%，RSD分别为0.79%，0.74%，0.48%和0.45%（n=9）。自研制剂和参比制剂在水和pH 1.2盐酸溶液中的溶出度相似因子分别为57和55，在pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.5磷酸盐缓冲液中15 min的溶出度均大于85%。

结论  本方法快速、准确，可用于头孢克肟颗粒溶出度的测定，为头孢克肟颗粒的体外溶出曲线一致性评价提供参考。

头孢克肟为日本藤泽制药株式会社研发的原研品种，为全球首个口服第三代头孢菌素，临床上广泛用于治疗敏感菌所致的呼吸系统、尿道、胆道等感染，剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂等[1-2]。头孢克肟属于生物药剂学药物分布分类系统的4类药物（低溶解性、低渗透性）[3]。对于口服固体制剂，药物起效需要经过崩解、溶出和吸收的过程，通过研究药物体外溶出曲线，可了解制剂的关键溶出属性，一方面可以提高临床生物等效的成功率，另一方面可以为药物上市后变更处方工艺的质量评估提供依据。

2016年2月6日，国务院明确指出，凡是未按照与原研药品质量和疗效一致原则获批上市的仿制药，均需开展一致性评价[4]，其中对多个介质的溶出曲线研究是一致性评价的关键评价指标之一。随着一致性评价工作的开展，溶出曲线的测定任务较以往相比增加了数百倍甚至上千倍。中国药典2020年版二部[5]收载了头孢克肟系列制剂的溶出度测定方法，均为紫外-可见分光光度法，需要对溶出液进行稀释操作，且准确度和专属性较差。日本橙皮书[6]收载了头孢克肟颗粒多个溶出介质的溶出曲线测定方法，采用常规液相色谱柱，单个样品检测耗时15~20 min，检测效率较低。近年来，随着新型核壳型色谱填料的发现[7-8]，多个色谱柱品牌厂家已陆续推出新型核壳型色谱柱产品，该类型色谱柱使用核壳型填料，具有低背压、高柱效、兼容HPLC与UPLC平台等特点，与普通微粒多孔硅胶色谱柱相比，核壳型填料通过熔融核技术将多孔硅胶壳熔融到实心硅胶颗粒表面，减小液体流经时的扩散路径，在同样的流速下能获得比普通型色谱柱更好的分离度，亦可承受高流速带来的压力，缩短分析时间、提高检测效率，是近年来色谱柱的发展潮流。目前核壳型色谱柱主要应用于食品、中药等复杂多组分的分析研究[9-15]。本试验采用核壳型色谱柱，建立了HPLC法快速测定头孢克肟颗粒溶出度的分析方法，并比较自研制剂和参比制剂在多个介质中的溶出行为，为头孢克肟颗粒的一致性评价研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo UltiMate 3000型HPLC仪，配备DAD检测器、四元泵、自动进样器、柱温箱（美国Thermo公司）；CPA225D电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；FAVD-25智能真空脱气仪（上海富科思分析仪器有限公司）；FADT-1202RC自动溶出仪（上海富科思分析仪器有限公司）；SHZ-B水浴恒温振荡器（广州科晓科学仪器有限公司）。

1.2 试药

头孢克肟细粒（参比制剂，长生堂制药株式会社，规格：50 mg，批号：BL151）；头孢克肟颗粒（自研制剂，规格：50 mg，批号：G1802001）；头孢克肟颗粒空白辅料（自制，广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂，批号：F171022）；头孢克肟（原料药，浙江普洛得邦制药有限公司，批号：AP004-1903-2074）；头孢克肟对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130503-201706，含量89.2%）；磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氢氧化钠、枸橼酸、氯化钠、盐酸为分析纯；三氟乙酸、乙腈、甲醇为色谱纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶出方法的选择

参考中国药典2020年版二部[5]和日本橙皮书[6]收载的头孢克肟颗粒溶出度试验方法，采用桨法、50 r·min^-1、介质900 mL的条件进行溶出试验，并采用水、pH 1.2盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.5磷酸盐缓冲液为溶出介质。

2.2 平衡溶解度的测定

测定头孢克肟在水、pH 1.2盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.5磷酸盐缓冲液介质中的平衡溶解度。精密称取1 g头孢克肟原料，置于具塞锥形瓶中，分别加入上述介质25 mL，将锥形瓶置于37℃恒温水浴振荡器中振荡24 h后取样，过滤，取续滤液稀释，采用HPLC法进行测定，计算得头孢克肟在各溶出介质中的平衡溶解度分别为0.623 0，1.283 0，7.457 0，11.623 0 mg·mL^-1（n=3）。

2.3 分析方法的建立

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore  C₁₈（50 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流动相：0.8%三氟乙酸水溶液-乙腈（80 ∶ 20）；流速：1.2 mL·min^-1；检测波长：254 nm；柱温：45℃；进样量：5 μL。

2.3.2 系统适用性试验

空白辅料溶液的配制：取头孢克肟颗粒空白辅料适量，置100 mL量瓶中，分别加入不同溶出介质溶解并稀释定容，即得。

对照品溶液的配制：精密称取头孢克肟对照品适量（以 C₁₆H₁₅N₅O₇S₂计约100 mg），置100 mL量瓶中，加适量甲醇溶解，加水稀释定容，摇匀，作为头孢克肟对照品贮备液。取贮备液适量，分别加入相应溶出介质稀释制成每1 mL中约含有头孢克肟（以 C₁₆H₁₅N₅O₇S₂计）56 μg的对照品溶液。

供试品溶液的配制：取头孢克肟颗粒50 mg，按“2.1”项下溶出条件进行溶出试验，于不同时间点取溶出液适量。

分别取空白溶出介质、空白辅料溶液、对照品溶液和供试品溶液，过0.45 μm滤膜后取续滤液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，色谱图见图1。结果表明，4种溶出介质及空白辅料均无相关色谱峰，对照品溶液中主峰与供试品中主峰一致，该法专属性良好，符合系统适用性要求。

采用日本橙皮书[6]收载的头孢克肟颗粒溶出度试验方法和本文方法的典型色谱图见图2。

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  图1 系统适用性试验HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatograms of the system suitability test

  注：1为空白介质；2为空白辅料；3为对照品；4为供试品

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  图2 供试品溶液采用不同分析方法的HPLC色谱图

  Figure 2.HPLC chromatograms of test solution detected by different analytical methods

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2.3.3 线性关系考察

取“2.3.2”项下贮备液适量，用4种溶出介质分别稀释成10.05，50.26，100.52，150.78，201.04，251.30 μg·mL^-1浓度的线性溶液。按“2.3.1”项下色谱条件测定。以峰面积（A）对头孢克肟的浓度（C，μg·mL^-1）进行回归计算，计算得线性回归方程见表1。结果显示，头孢克肟在10.05~251.30 μg·mL^-1浓度范围内，与峰面积呈良好线性关系。

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  表格1 头孢克肟在4种介质的线性回归结果

  Table 1.Linear regression results of cefixime in four different dissolution media

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2.3.4 精密度试验

取“2.3.3”项下4种介质的对照品溶液（50.26 μg·mL^-1）连续进样测定6次，得到主峰峰面积的RSD分别为0.30%，0.11%，0.08%和0.21%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.5 滤膜吸附试验

取“2.3.2”项下4种介质于30 min取样的供试品溶液两份，一份离心（2 639×g）10 min后取上清液，另一份经0.45 μm聚醚砜滤膜过滤，弃去约0.5 mL滤液，取续滤液，分别进样测定，计算得头孢克肟的回收率（%，滤液峰面积/离心液峰面积×100%）分别为99.7%，99.7%，99.8%和99.6%（n=3）。结果表明0.45 μm聚醚砜滤膜对头孢克肟无明显吸附作用。

2.3.6 重复性试验

取样品，按“2.3.2”项下制备4种介质的供试品，水和pH 1.2介质于120 min取样，pH 6.8介质和pH 7.5介质于30 min取样，每个介质平行取样6份，过0.45 μm滤膜后进样测定，计算得4个介质的平均溶出度分别为100.8%，99.1%，101.2%和101.8%，RSD分别为0.28%，0.33%，0.51%和0.39%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.3.7 回收率试验

取空白辅料适量，加入“2.3.2”项下头孢克肟对照品贮备液，并用相应的介质稀释制备成相当于标示量溶液的50%，75%和100%的梯度溶液，每个浓度平行制备3份，进样测定。计算得头孢克肟在水、pH 1.2盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.5磷酸盐缓冲液介质中的平均回收率分别为99.3%，99.1%，100.2%和99.8%，RSD分别为0.79%，0.74%，0.48%和0.45%（n=9）。

2.3.8 溶液稳定性试验

取样品，按“2.3.2”项下制备4种介质的供试品，水和pH 1.2介质于120 min取样，pH 6.8介质和pH 7.5介质于30 min取样，过滤后于25℃条件下避光放置，于0，2，4，6，8 h进样测定，计算各时间点峰面积与0时峰面积的比值，结果见表2。结果表明各介质供试品溶液在25℃避光条件下8 h内稳定。

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  表格2 4种介质头孢克肟供试品溶液稳定性结果（n=5, %）

  Table 2.Stability results of cefixime test solutions in four media (n=5, %)

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2.4 自研制剂和参比制剂的溶出曲线测定与评价

取头孢克肟颗粒自研制剂和参比制剂各12袋，参照中国药典2020版四部通则0931第二法[16]，分别以水、pH 1.2盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.5磷酸盐缓冲液900 mL为溶出介质，在转速50 r·min^-1、温度37℃条件下试验。于不同时间点分别取样1.5 mL，经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液测定，按外标法计算头孢克肟颗粒的累积溶出度，溶出曲线见图3。根据溶出结果对自研制剂和参比制剂的溶出曲线进行相似性评价[17]，结果显示，在pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 7.5磷酸盐缓冲液中，自研制剂和参比制剂在15 min溶出度均大于85%，可判断两制剂的溶出行为相似；在水和pH 1.2盐酸溶液中，自研制剂和参比制剂的溶出度相似因子（f₂）分别为57和55，也表明两制剂的溶出行为相似。f₂计算公式如下：

式中R_t为t时间参比制剂平均溶出量，T_t为t时间受试制剂平均溶出量，n为取样点个数。

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  图3 头孢克肟颗粒自研制剂和参比制剂在4种介质中的溶出曲线（n=12）

  Figure 3.Dissolution curves of cefixime granules from self-developed and RLD in four media (n=12)

  注：A为水；B为pH 1.2盐酸溶液；C为pH 6.8磷酸盐缓冲液；D为pH 7.5磷酸盐缓冲液

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3 讨论

核壳型色谱填料是将多孔硅胶壳熔融到实心硅胶颗粒的材料，粒径分布极窄，具有轴向和纵向扩散小的优点，该类型色谱柱反压低，在常规HPLC仪即可实现UPLC仪的分离效果。日本橙皮书中收载的头孢克肟颗粒溶出度检测方法以1.92% 四丁基氢氧化铵溶液（用10%磷酸调pH至6.5）-乙腈（3 ∶ 1）为流动相，采用常规 C₁₈色谱柱的检测时间较长，本试验尝试在该色谱条件下改用核壳柱进行试验，头孢克肟的出峰时间约1.9 min，但经过几个批次样品检测后，峰形出现前倾，柱效显著降低，提示该流动相体系对该类型色谱柱损耗较大，不适合高通量样品的检测。本研究采用核壳型色谱柱，对色谱条件进行了开发和优化，实现了目标检测化合物可在1 min内完成出峰，大幅度地缩短了样品的检测时间，有效提高了检测效率，且色谱柱损耗低，溶剂耗费较少，较好地解决了一致性评价过程中高通量样品的检测问题。

头孢克肟为难溶性药物，体外的溶出行为差异在一定程度上反映了产品的内在质量，通过比较产品在多个介质的溶出曲线，可提高生物等效性试验的成功率，本试验结果表明，自研制剂和参比制剂在多个介质的体外溶出行为一致。通过生物等效性研究[18]，受试者在空腹和餐后状态下分别服用头孢克肟颗粒自研制剂和参比制剂，其关键药动学参数[药物峰浓度（C_max）、药物浓度-时间曲线下面积（AUC_0-t和AUC_0-∞）]的几何均值比的90%置信区间均落在了生物等效的判断标准范围（80%~125%）内，表明自研制剂和参比制剂具有生物等效性。结合头孢克肟颗粒的体外和体内研究结果，表明本研究的溶出条件下的溶出曲线与体内吸收具有一定相关性，可为头孢克肟产品的研发、生产和上市后变更提供参考。

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