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目的 基于宏基因组技术研究哈蟆油（OR）对大鼠肠道菌群的影响，用组学技术表征OR的功效。
方法 雄性SD大鼠随机分为对照组和OR组。OR组大鼠以200 mg·kg-1剂量的OR匀浆每日灌胃，对照组以等体积生理盐水灌胃。14 d后，采集大鼠粪便进行宏基因组测序，对测序结果进行基因预测、丰度分析、物种注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能注释。
结果 在门水平上OR可以显著升高放线菌门相对丰度（P＜0.05），在纲水平上OR可以显著升高放线菌纲相对丰度（P＜0.05），在目水平上OR可以显著升高双歧杆菌目相对丰度（P＜0.05）。两组大鼠肠道菌群在门和属水平上的β多样性存在差异。线性判别效应大小分析（LEfSe）筛选出两组间35种显著差异菌种。KEGG功能注释结果显示，在Level 1层级上注释到新陈代谢类通路的基因最多。组间差异分析表明，OR组注释到免疫系统、环境适应及癌症相关通路的相对丰度产生变化。
结论 改变大鼠肠道菌群相对丰度及多样性、调节脂质及氨基酸代谢通路可能是OR营养保健和治疗疾病的潜在机制。
哈蟆油（Oviductus Ranae，OR）也被称为林蛙油、雪蛤油等，是成熟雌性东北林蛙输卵管的干燥品，首见于宋朝苏颂《本草经》。中国药典自1985年版起收载哈蟆油至今，其功能主治为“补肾益精、润肺养阴。用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血”[1]。文献[2-3]报道，OR还具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、雌激素样、保肝、降血脂和抗骨质疏松等药理作用。此外，OR被作为膳食补充剂或营养保健品，在中国有着数百年的使用历史[4]，被健康或亚健康人群广泛食用。
OR相关研究[2,5-6]包括化学成分的分析、基于细胞或动物模型的药理研究等，但这些研究大多年代久远，方法简单，文献较少，鲜有学者采用中医药现代化研究方法对其进行持续和深入的关注。中药可以通过调节肠道菌群多样性以及群落结构组成、脑-肠轴等互作机制[7-8]，起到缓解和治疗疾病以及提高药物疗效等作用[9-11]。研究中药对肠道菌群的影响，乃至这些影响与疾病发生发展之间的关系，已经成为中医药现代化研究的前沿与热点[12-13]。宏基因组测序是目前研究肠道菌群的主流方法，可以解析微生物系统的功能和分类[14]，并将基因数据与微生物组成和功能联系起来，是一种研究药物作用机制的组学研究新方法[15]。从肠道菌群角度研究OR作用机制的文献尚未见报道。
本研究采用宏基因组测序技术，以健康对照组大鼠和服用OR 14 d后大鼠的粪便为研究对象，比较两组大鼠肠道菌群的物种组成、相对丰度、多样性以及功能的差异，探究OR治疗疾病和营养保健的潜在作用机制。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
Qubit 2.0 荧光定量仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Covaris S220超声波核酸破碎仪（美国Covaris公司）；Agilent 2100生物分析仪（美国Agilent 公司）；Illumina NovaSeq6000测序仪（美国Illumina公司）。
OR收购于吉林省长白朝鲜族自治县，经湖北省药品监督检验研究院肖凌副主任药师鉴定，符合中国药典2020年版规定。室温条件下，精密称量8 g OR并加入适量蒸馏水，充分泡发24 h后匀浆处理，定容至400 mL继续混匀，配置成20 mg·mL-1的OR匀浆，于0 ℃冰箱保存备用。
磁珠法粪便基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号：DP180427）；NEBNext® Ultra™ DNA文库制备试剂盒（美国NEB公司，批号：E7645S）。
1.2 动物
SPF级雄性SD健康大鼠8只，体重（150± 15）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物质量合格证号：SCXK(京)2019-0010。在实验开始前，将大鼠置于温度20~25℃、相对湿度40%~70%、12 h暗/光循环、自由饮水及饮食条件下，适应性饲养3 d。本研究获得武汉大学中南医院实验动物福利伦理委员会的批准（批准号：ZN2021244）。
1.3 方法
1.3.1 动物分组、给药及样本采集
将8只大鼠随机分为对照（Con）组和OR组，每组4只。中国药典2020年版规定哈蟆油每日用量5~15 g，根据人与大鼠用药剂量换算公式[16]和药材入汤剂煎煮与粉末入药剂量区别换算方法[17]，选定大鼠的OR用药剂量为200 mg·kg-1·d-1。OR组大鼠每天灌胃给药1次，Con组大鼠以相同体积的生理盐水灌胃，连续用药14 d。末次给药24 h后，轻压大鼠下腹部刺激排便，用灭菌冻存管收集2~3颗粪便，液氮速冻在-80℃条件下保存，直到运送至实验室进行测序分析。
1.3.2 宏基因组检测与分析
1.3.2.1 DNA提取与质量检测、文库构建及宏基因组测序
使用磁珠法粪便基因组DNA提取试剂盒对每个大鼠粪便样本（0.5 g）进行单独处理，提取各样本的总DNA。使用1% （w/v）的琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 的纯度和完整性，荧光定量仪对 DNA 浓度进行准确定量。其次，质量检测合格的 DNA 样品用超声波核酸破碎仪随机打断成长度约为 350 bp 的片段，使用NEBNext® Ultra™ DNA文库制备试剂盒进行文库制备。文库构建完成后使用Agilent 2100生物分析仪对文库的插入片段长度进行检测，用 Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求混合建库后进行 Illumina PE150 测序。
1.3.2.2 宏基因组数据预处理和组装
使用readfq对 Illumina HiSeq 测序平台获得的原始数据（Raw Data）进行预处理，获取用于后续分析的有效数据（Clean Data）。使用SOAPdenovo软件，对有效数据进行组合，以获得不连续长序列（Scaffolds）。将组装得到的 Scaffolds 从 N 连接处打断，得到不含 N 的序列片段，称为 Scaftigs，过滤掉500 bp以下的片段，并进行统计分析和后续基因预测。
1.3.2.3 基因预测、丰度分析、物种及功能注释
使用MetaGeneMark软件对每个样本的Scaftigs（≥500 bp）进行开放阅读框（ORF）预测，然后使用CD-hit程序从预测的ORF（≥100 nt）中去除冗余部分，以获得每个样品的非冗余的初始基因目录。继续使用Bowtie2软件将每个样本的读数与初始基因目录重新对齐获得最终用于后续分析的基因序列集合（Unigenes）。基因的相对丰度通过使用测序序列的数量和基因长度进行计算。使用Diamond软件将 Unigenes 与从 NR_ Meta 数据库中抽提出的细菌、真菌、古菌和病毒序列进行比对注释（采用生物大分子序列比对搜索工具，E值≤ 1×10-5）。结合美国国家生物技术信息中心的物种分类系统，获得了不同分类学层次的物种注释信息。同样，通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库获得了Unigenes的功能注释。
1.4 统计学分析
使用 R 软件（Version 4.1.2）绘制主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）图。PCoA使用 R软件的stats和ggplot2软件包，NMDS使用 R 软件的 vegan 软件包。使用 R 软件进行β多样性指数组间差异分析，选用 t检验和 Wilcoxon 检验。线性判别效应大小分析（LEfSe）用于寻找样本的生物标志物，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 数据质量控制
通过测序仪获得的原始数据存在一定比例低质量数据，为了保证后续分析结果准确可靠，需要对原始的测序数据进行预处理，获取用于后续分析的有效数据，预处理结果见表1。Con组的每个样本平均有6 615.68个原始数据，经过质量控制平均获得了6 589.33个有效数据。OR组的每个样本平均有6 605.14个原始数据，经过质量控制平均获得了6 568.02个有效数据。G+C碱基数量占比约47.00%，在所有文库中某一碱基质量值占全部碱基数的20%（Q20）不小于97.20%，某一碱基质量值占全部碱基数的30%（Q30）不小于92.30%，说明数据质量较好，可用于后续分析。
2.2 Con组和OR组大鼠肠道菌群组成
菌种组成可以直观反映菌群的基本特征。如图1-A所示，在门水平上本实验的两组大鼠肠道菌群组成相同，相对丰度排名前10的优势物种包括：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、衣原体门（Chlamydiae）、螺旋体门（Spirochaetes）、迷踪菌门（Elusimicrobia）、梭杆菌门（Fusobacteria）。厚壁菌门是两组中相对丰度最高的物种，在Con组中占44.40%，OR组中占50.29%；拟杆菌门是两组中第2丰富的物种，分别占38.57%和32.00%；变形菌门是门水平上两组大鼠肠道中第3丰富的物种，分别占0.81%和1.08%。虽然两组间丰度前10的菌门组成类别相同，但各菌门相对丰度存在差异。其中，与Con组大鼠相比，服用OR可以显著升高大鼠肠道放线菌门（Actinobacteria）相对丰度（P＜0.05）。
在纲水平上，如图1-B所示，拟杆菌纲 （Bacteroidia）、梭菌纲 （Clostridia）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、厚壁菌纲（Negativicutes）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、丹毒丝菌纲（Erysipelotrichia）、放线菌纲（Actinobacteria）、柔膜菌纲（Mollicutes）、红蝽菌纲（Coriobacteriia）及ε-变形菌纲（Epsilonproteobacteria）是两组大鼠肠道菌群相对丰度前10的优势物种，两者组成也相同。除拟杆菌纲和芽孢杆菌纲外，与Con组相比，OR组大鼠肠道中上述优势物种相对丰度均升高，其中放线菌纲（Actinobacteria）相对丰度差异有统计学意义（P＜0.05）。
如图1-C所示，在目水平上，拟杆菌目（Bacteroidales）、梭菌目（Clostridiales）、乳酸杆菌目（Lactobacillales）及氨基酸球菌目（Acidaminococcales）在两组中检出的相对丰度总和达70%以上。与Con组相比，OR组肠道中双歧杆菌目（Bifidobacteriales）的相对丰度显著升高（P＜0.05）。
2.3 Con组和OR组大鼠肠道菌群的多样性分析
β多样性分析显示，两组大鼠的肠道菌群存在差异。PCoA得出的结果如图2-A所示，在门水平上可以将两组实验动物的肠道菌群很好地分开，NMDS在属水平上可以将两组大鼠的肠道菌群分开，如图2-B所示。提示OR改变了大鼠的肠道菌群结构。
2.4 Con组和OR组大鼠肠道菌群差异显著菌种
为了进一步探索组间肠道菌群的差异，使用LEfSe分析在各分类水平上寻找两组间在丰度上有显著差异的菌种，线性判别分析（LDA）阈值设为 3，P＜0.05，共筛选出35个差异显著菌种。如图3-A所示，Con组仅在种水平上找到了显著差异菌，而OR组在纲、属及种水平上均存在显著差异菌。其中Con组的显著差异菌主要包括普雷沃菌和产乙酸嗜蛋白质菌。OR组的显著差异菌包括放线菌纲、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、孢杆菌属（Sporobacter）及种水平上的双歧杆菌、厚壁菌、沙门菌等，进化分支树显示放线菌纲是在OR组中起重要作用的菌群，如图3-B所示。
2.5 Con组和OR组大鼠肠道菌群KEGG数据库功能注释及富集分析
图4-A显示，在Con组和OR组中共检测到1 596 634个基因，其中OR组特有基因212 022个，Con组特有基因145 223个。从 Unigenes 注释结果出发，绘制KEGG数据库中的注释基因数目统计图，如图4-C所示，被注释到信号转导（signal transduction）、复制和修复（replication and repair）以及折叠、分类和降解（folding, sorting and degradation）的基因数量排名前3。此外，在Level 1水平上注释到新陈代谢类通路的基因最多，提示大鼠肠道内的菌群主要与能量获取相关。在 Level 2 水平上，绘制相对丰度前 35通路的热图，如图4-B所示，两组大鼠肠道菌群主要富集到脂质代谢（lipid metabolism）、氨基酸代谢（metabolism of other amino acids）等通路。两组间差异分析显示，OR组大鼠肠道菌群注释到免疫系统（immune system）、环境适应（environmental adaptation）及癌症（cancers）相关通路的相对丰度产生了变化。
3 讨论
3.1 OR可以改变大鼠肠道菌群结构及多样性
本研究在门、纲、目水平分析Con组与OR组大鼠肠道菌群组成，发现两组大鼠相对丰度排名前10的菌群种类相同，但是排名前10的菌群相对丰度值发生了变化，在门水平上OR可以显著升高放线菌门相对丰度，在纲水平上OR可以显著升高放线菌纲相对丰度，在目水平上OR可以显著升高双歧杆菌目相对丰度，表明OR是通过调节菌群的丰度变化进而影响大鼠肠道菌群的结构。放线菌是天然药物的重要来源, 其代谢活性物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等活性，放线菌是新抗生素产生的主要来源[18]。此外放线菌也参与肠道的能量供应[19]、抗性淀粉的降解以及亚油酸转化为共轭亚油酸的过程，具有潜在的疾病治疗作用，如抗癌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗肥胖和增强免疫功能[20]。双歧杆菌目归属于放线菌门下的放线菌纲，其可以从碳水化合物发酵中产生短链脂肪酸[21]，进而获得乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，高浓度的乙酸盐可以保护宿主免受肠道致病性感染。本研究提示OR可能通过升高大鼠肠道放线菌门、放线菌纲及双歧杆菌目的相对丰度，进而调节代谢、免疫抗炎相关功能使大鼠获益。
组间肠道菌群的LEfSe分析表明，Con组的显著差异菌是普雷沃菌和产乙酸嗜蛋白质菌，OR组的显著差异菌是放线菌纲、双歧杆菌属等。有报道[22]指出，普雷沃菌具有较强的复杂性多糖降解能力，可以增进宿主对单糖的吸收。产乙酸嗜蛋白质菌是一种厌氧、可水解蛋白的细菌。进一步组间分析显示，OR组普雷沃菌的相对丰度较高，提示OR发挥作用可能是通过提高普雷沃菌丰度，从而增强大鼠对糖类的降解与吸收能力。
3.2 OR可能调节免疫、环境适应及癌症相关通路
除了对大鼠肠道菌群进行物种注释及丰度分析外，本研究还在KEGG数据库中对肠道菌群进行功能注释。KEGG功能注释结果表明，两组大鼠的肠道菌群均注释到与新陈代谢相关的基因，通过影响脂质代谢、氨基酸代谢等与新陈代谢相关的通路发挥作用。进一步组间差异分析显示，服用OR后注释到免疫系统、环境适应及癌症相关通路的相对丰度产生了变化，提示OR的诸多生物学功能可能与上述通路有关，但是本研究未能深入阐释OR调节大鼠代谢的分子生物学机制，仍有待进一步深入研究。
综上所述，本研究基于宏基因组学技术发现，OR可以调节大鼠肠道菌群的结构和多样性，并影响机体脂质及氨基酸代谢相关通路的功能，这些影响可能是OR营养保健和治疗疾病的潜在机制。此外，服用OR后大鼠的免疫系统、环境适应及癌症相关通路发生变化，但OR与上述通路变化之间的具体关联尚不明确，在后续研究中将会对此进行深入分析。
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