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目的 建立快速测定六神曲中7种真菌毒素残留的超高效液相色谱-串联质谱方法。
方法 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为乙腈-含0.1 %甲酸的5 mmol· L-1甲酸氨溶液，梯度洗脱，流速为0.4 mL·min-1，柱温为30℃。采用电喷雾离子源，正离子模式，工作模式为多反应监测模式。
结果 该方法专属性好，7种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数r在0.9987~0.9995之间，平均回收率为84.7%~108.0%，RSD为2.8%~5.8%（n=6）。实际样测定中，10批样品中共有2批检出黄曲霉毒素B1，含量分别为1.24，2.35 μg·kg-1，其余毒素均未检出。
结论 该方法快速、简便、回收率高，适用于六神曲中真菌毒素的质量监测。
六神曲又名六曲、神曲，被誉为中药第一曲，最早收载于唐代的《药性论》[1]，是由苦杏仁、赤小豆、青蒿、苍耳、辣蓼药5种药材加入面粉和麦麸混合后，再经发酵而制成的曲剂[2]。六神曲具有健脾和胃、消食调中等功效[3]，是中药中重要的健胃消食药，尤其善于消米食[4]。现代研究发现六神曲可以促进胃泌素、胆碱酯酶等的分泌增加，降低血清中一氧化氮的含量，从而增强肠胃消化功能[5]。此外，现代研究还发现六神曲具有抗菌活性和修复肠道溃疡、增强平滑肌收缩等功能[4]。
真菌毒素是真菌在生长过程中产生的有毒有害的次生代谢产物，存在于中药材、食品、农作物和饲料等中[6]。目前报道的真菌毒素共有400多种，其中典型的有黄曲霉毒素、伏马菌素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等，这些毒素对人体有致畸、致癌、致突变等毒性[7-8]。中国药典2020年版规定了桃仁、地龙等24种中药材中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种毒素总量的限度要求[9]。《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量 》（GB 2761-2017）规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的限量指标[10]。《饲料卫生标准》（GB 13078-2017）规定了黄曲霉毒素B1在不同饲料中的限量要求。《饲料卫生标准饲料中赭曲霉素A和玉米赤霉烯酮的允许量》（GB 13078.2-2006）规定配方饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉素A限量要求。《配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇允许量》（GB 13078.3-2007）规定了配方饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量要求。六神曲在制备过程中需要经过发酵工艺，而发酵过程中可能会滋生真菌。已有文献报道[11]从六神曲中分离得到黄曲霉菌、青霉菌、黑曲霉菌、枝孢霉等真菌。混入的真菌在生长和代谢过程中很可能产生真菌毒素，从而污染六神曲，带来安全风险。韩凤等[12]在六神曲中检测到黄曲霉毒素G2，石柳[13]在六神曲中检测到黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赫曲霉毒素A，但目前关于六神曲中其他真菌毒素检测的文献报道较少，因此亟需建立六神曲中多种真菌毒素的检测方法并评估其污染状况。本文选择了毒性较强，可对人体健康造成重大危害，且中药和食品等行业法律法规重点关注的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏马菌素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇 7种毒素作为监测指标，评价六神曲中真菌毒素的暴露水平。
目前，真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法、薄层色谱法、液相色谱荧光检测器法、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等[14]。其中LC-MS/MS法因灵敏度高、快速、专属性强特别适合于真菌毒素的高通量检测[15]。本文采用超高效液相色谱/串联质谱法（UPLC-MS/MS）建立起一种快速、高选择性的检测方法，能够同时测定7种真菌毒素，并应用该方法实际评估了六神曲样品的真菌毒素污染水平，为六神曲的质量监控和风险评估提供了科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters UPLC Xevo TQ-S超高效液相色谱-质谱联用仪，含有超高效液相色谱仪、电喷雾离子化源和三重四级杆质量分析器（美国沃特世公司）；METTLER AE-200型万分之一电子天平和METTLER XS105DU型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SK5200HP型超声波提取器（上海科导公司）；MILLI-Q超纯水制备仪（美国密理博公司）。
1.2 试药
黄曲霉毒素混合对照品（批号：352733，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2浓度分别为0.9，0.3，0.9，0.3 μg·mL-1）购自Organic Standards Solutions International（O2Si）公司；黄曲霉毒素M1对照品（批号：O3430095，浓度：10.5 μg·mL-1）购自安谱公司；脱氧雪腐镰刀菌烯醇对照品（批号：349508，浓度：200 μg·mL-1）购自O2Si公司；伏马菌素B1对照品（批号：SZBE295XV，浓度：50 μg·mL-1）购自Sigma公司；甲醇和乙腈购自默克公司，均为色谱纯；甲酸购自Anaqua Chemical Supply公司，为质谱纯；水为Milli-Q制备的超纯水；Oasis PRiME HLB柱（3 cc/60 mg）固相萃取小柱购自Waters公司；QuEChERS提取盐包（包括4 g硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸氰二钠）购自安谱公司。
六神曲样品购自本地中药材市场(样品1：产地安徽，批号：20180521；样品2：产地安徽，批号：20180711；样品3：产地安徽，批号：20190507；样品4：产地福建，批号：20190315；样品5：产地福建，批号20181107；样品6：产地广东，批号20180311；样品7：产地广东，批号：20190120；样品8：产地广东，批号：20190215；样品9：产地四川，批号：20180316；样品10：产地四川，批号：20190718)。
2 方法与结果
2.1 色谱-质谱条件
2.1.1 色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈(A)-含0.1%甲酸的5mmol·L-1甲酸氨溶液(B)，梯度洗脱程序见表1；流速：0.4 mL·min-1，柱温：30℃，进样量：5 μL。
2.1.2 质谱条件
离子源：电喷雾电离源；离子模式：正离子模式；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650 L·h-1；扫描方式：多反应检测模式；其余检测离子参数见表2。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液
取7种真菌毒素对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准溶液储备液（黄曲霉毒素B1浓度为18 ng·mL-1，黄曲霉毒素B2浓度为6 ng·mL-1，黄曲霉毒素G1浓度为18 ng·mL-1，黄曲霉毒素G2浓度为6 ng·mL-1，黄曲霉毒素M1浓度为21 ng·mL-1，脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为4 000 ng·mL-1，伏马菌素B1浓度为1 000 ng·mL-1），于棕色试剂瓶中-18℃避光保存，测定当天用流动相稀释得到系列标准曲线，现配现用。
2.2.2 样品的处理
取已均质后的六神曲供试品1 g，精密称定，置50 mL的离心管中，加入5 mL水和10 mL的 0.1 %甲酸乙腈，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）10 min，加入提取盐包（EN法），大力振摇1 min，离心（6 000×g ）5 min，取提取液2 mL上样Oasis PRiME HLB柱（无需活化直接上样）接收流出液，取流出液1 mL于50℃下旋转蒸干，用流动相溶解旋蒸后的残渣并定容至1 mL，再经过0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。
2.2.3 空白样品溶液
取经检测不含有7种真菌毒素的六神曲1 g，按“2.2.2”项下方法进行前处理，得到空白样品溶液。
2.3 方法专属性
上述色谱-质谱条件下，对照品的7种真菌毒素的MRM定量离子图见图1，空白样品的7种真菌毒素的MRM定量离子图见图2。从图中可知7种真菌毒素分离良好，空白样品的图谱表明样品基质成分不干扰真菌毒素的检测。
2.4 线性关系考察
取“2.2.1”项下的对照品溶液用流动相依次稀释，得到标准工作溶液，分别精密吸取系列标准工作溶液10 µL，按“2.1”项下试验条件测定，以待测化合物的峰面积作为纵坐标（Y）,以标准曲线的浓度为横坐标（X，ng·mL-1），绘制线形回归方程，得线性回归方程，见表3。
2.5 定量限和检测限测定
将真菌毒素混合对照品溶液用流动相稀释，按“2.1”项下试验条件测定，以信噪比（S/N）=3确定检测限，以信噪比（S/N）=10确定定量限，结果见表3。
2.6 回收率试验
精密称取六神曲空白样品，取约1 g，按照低、中、高3个浓度水平加入真菌毒素混合对照品适量（每个浓度水平制备6份样品），按照“2.2”项下的试验方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件测定，用外标法计算各真菌毒素的回收率和其RSD，结果见表3。结果表明，7种真菌毒素的平均回收率为84.7%~108.0%，RSD为2.8%~5.8%（n=6）。因此本方法回收率好，准确性高。
2.7 实际样品测定
取10批六神曲制剂，按照“2.2”项下的试验方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件测定，用外标曲线法定量，计算样品中真菌毒素的含量。结果10批样品中共有2批检出黄曲霉毒素B1，含量分别为1.24，2.35 μg·kg-1（n=3），其余毒素均未检出。
3 讨论
3.1 检测方法的选择
真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、薄层色谱法（TLC）、液相色谱荧光检测器法（LC-FLD）、液相色谱-串联质谱法等（LC-MS/MS）[14]。酶联免疫吸附法（ELISA）操作简单，检测时间短，但检测结果受试剂盒差异、仪器灵敏度等条件的影响较大，重复性较差、假阳性率较高。薄层色谱法（TLC）对仪器设备要求较低，但灵敏度较低，专属性较差，假阳性率和假阴性率较高。液相色谱荧光检测器法（LC-FLD）采用免疫亲和柱纯化和柱后碘衍生或柱后光衍生相结合的方法，其灵敏度较高，但其前处理复杂、对人员的操作要求较高、检测成本高，不适合大批量药材的检测要求。液相色谱-串联质法（LC-MS/MS）前处理简单，灵敏度高，检测时间短，专属性强，可同时进行定性和定量测定，一次进样可同时检测多种真菌毒素，整个分析时间仅有几分钟，特别适合大批量中药材中真菌毒素污染情况的快速、准确和高通量筛查。
3.2 色谱质谱条件
本文测定的7种真菌毒素在质谱方法优化过程中，将真菌毒素的混标标准储备液利用针泵直接进质谱测定，同时比较正离子和负离子模式下的响应值。结果各真菌毒素在正离子模式下的响应值明显高于负离子模式，因此选择显示正离子模式作为电离模式。正离子模式下通过针泵直接进样优化了离子源的参数，使响应值达到最优。设置最优离子源参数后，利用针泵分别优化了7种真菌毒素的子离子碎片和碰撞能量参数，选择了其中响应值最高的子离子作为各待测组分的检测定量离子对，选择响应值次高的子离子作为待测组分的定性离子对，最终建立了本文中真菌毒素检测的多反应检测模式方法。
在正离子电离模式下，液相流动相中添加酸性缓冲盐体系既可增加电离环境中的氢质子，提高待测组分的电离效率，增强响应值，又可以改善色谱峰形和分离度，提高分离效果。试验中分别考察了乙腈-5 mmol·L-1甲酸铵体系、乙腈-0.1%甲酸体系和乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol·L-1甲酸氨体系。结果显示在乙腈-0.1%甲酸体系下，脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B1的响应值很强，但5种黄曲霉毒素的响应值很低；在乙腈-5 mmol·L-1甲酸铵体系下，黄曲霉毒素的响应值很强，但伏马菌素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的响应值很低，基本无质谱信号；而在乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol·L-1甲酸氨体系下，伏马菌素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和5种黄曲霉毒素的响应值均较高，且各组分峰形良好，分离度好。同时研究分别对甲醇和乙腈系统进行了对比，结果显示两者均能得到良好的峰形，但甲醇条件下，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的响应值较低，且色谱柱压力较高，故选择乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol·L-1甲酸氨体系作为梯度洗脱的流动相。
3.3 样品前处理
六神曲为6种中药材经过发酵等工艺制成的曲剂，样品中基质复杂，干扰成分较多，因此需选择适宜的方法进行前处理净化。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe）方法为一种基于固相萃取和基质固相分散技术的预处理方法，一般分为两步法，第一步采用缓冲盐体系萃取样品溶液，第二步加入固体附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的[16]。因为其前处理简单、快速、廉价、回收率高等特点广泛应用于谷物等农产品和中药材中的质量检测等。本文考察了QuEChERS方法对于7种真菌毒素的回收率，结果显示第一步加入缓冲盐体系萃取样品溶液时，各待测组分的回收率良好，但第二步加入PSA和C18吸附剂去除杂质后，脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B1的回收率很低，因此并不能采用QuEChERS两步法进行前处理净化。本文考虑采用QuEChERS方法结合固相萃取柱的方法进行前处理，样品经QuEChERS方法第一步萃取后，萃取液直接过Oasis PRiME HLB柱净化，结果显示7种真菌毒素的回收率均较好，因此本文最终选定了QuEChERS结合Oasis PRiME HLB柱的试验前处理方法。
3.4 结果分析
实际样品检测中有2批六神曲样品检出了黄曲霉毒素B1，含量分别为1.24，2.35 μg·kg-1，这揭示了六神曲发酵曲剂中存在着被黄曲霉毒素污染的风险，而目前关于六神曲的真菌毒素检测并没有相应的标准和法规，因此使用不加真菌毒素风险监控的六神曲存在健康风险。本文建立了一种快速、高效、准确性高的检测方法，可同时检测六神曲中7种真菌毒素，为六神曲中真菌毒素风险监控方法的建立提供了科学依据。
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